龍眼體細胞胚胎發(fā)生的蛋白質組學研究.pdf

1、本研究以龍眼(DimocarpuslonganLour.)“紅核子”品種LC2胚性細胞系為材料，進行體細胞胚胎發(fā)生及其同步化調控，獲取體細胞胚胎發(fā)生過程中各個主要發(fā)育階段的培養(yǎng)物，進行如下研究：①采用雙向電泳分析龍眼體胚發(fā)生過程中特異表達的蛋白；②分離純化體細胞胚胎發(fā)育后期特異表達的小肽；③進行小肽的肽質量指紋圖譜和串聯(lián)質譜鑒定，并用RT-PCR的方法克隆相關基因；④分析影響龍眼體胚小肽表達的因素。主要研究結果如下： 1.龍眼體

2、胚發(fā)生過程中特異表達蛋白的雙向電泳分析。龍眼胚性愈傷組織、球形胚、子葉胚、早期成熟胚、中期成熟胚、晚期成熟胚總蛋白的雙向電泳分析表明：①龍眼胚性愈傷組織中pI值在4～5之間的酸性蛋白表達種類最多，在體胚發(fā)育的過程中逐漸消失，相反，pI值在5～6之間的微酸性蛋白的表達逐漸增多；②體胚發(fā)育后期，尤其是成熟胚晚期，分子量大的蛋白大量減少，分子量較小的蛋白增多并逐漸積累；③雖然在各個發(fā)育階段都會出現(xiàn)一些新的特異蛋白，但是沒有改變蛋白質種類逐漸減

3、小的趨勢；④發(fā)現(xiàn)了一些有差異的特異蛋白點，尤其是成熟胚后期，有一系列大分子量的蛋白消失，新出現(xiàn)了一部分分子量較小的蛋白，其中幾種表達量很大，可能與體胚發(fā)育有密切關系，可供以后繼續(xù)深入研究。 2.龍眼體胚發(fā)生過程中特異表達小分子多肽的分離純化與鑒定。龍眼體細胞胚胎發(fā)生各個主要發(fā)育階段(胚性愈傷組織、球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚、成熟胚)總蛋白的SDS-PAGE分析表明：成熟胚階段出現(xiàn)的特異表達的小分子多肽，分子量在14.4kD以

4、下。除龍眼之外，如此小分子量的特異蛋白在植物體細胞胚胎發(fā)育的研究中尚未有報道。經典的SDS-PAGE的方法對分子量在15kD以下的小分子多肽分辨率不大。采用改進的Tricine-SDS-PAGE的方法分離龍眼體胚發(fā)生后期的小肽，得到較好的分離純化效果，小肽的分子量約在7.4kD左右。切下膠條首先做肽質量指紋圖譜(MALDI-TOF)分析，無法確定是何種類型小肽；進一步做串聯(lián)質譜(Q-TOF)分析，結果中有一個八肽的片段(AISTEKSK

5、)與一種熱帶魚(Roeboidesmagdalenae)的ATP合成酶亞基8的肽段中的一段吻合，而且分子量接近，因此推測此小肽可能是龍眼的ATP合成酶亞基8蛋白(ATPase8)。 3.龍眼胚性愈傷組織ATP合成酶亞基8基因(atp8)的cDNA克隆及其在體胚中的表達規(guī)律。根據(jù)GenBank中已公布的雙子葉植物atp8基因的序列，設計了正義、反義引物，用RT-PCR的方法克隆出313bp的核酸片段，克隆測序，與其他已知序列的雙子

6、葉植物同源性可達90％以上，但翻譯出的氨基酸序列卻沒有包括“AISTEKSK”八肽的片段。因為植物線粒體基因組的表達有編輯現(xiàn)象，會影響到翻譯的準確性，因此不能確定小肽與atp8基因是否對應。RT-PCR試驗結果顯示，atp8基因在胚性愈傷組織、子葉胚和成熟胚中的表達量基本相同。鑒于數(shù)據(jù)庫中有限的信息和分析技術的限制，此小肽的功能尚無法確定。 4.影響龍眼體胚小肽表達的因素分析。研究小肽的表達規(guī)律發(fā)現(xiàn)，小肽從成熟胚早期就有，但表達

7、量較小，隨著成熟時間的增加，表達量越來越大；適當增加培養(yǎng)基的滲透壓能使小肽的表達量增加。體胚在成熟的過程中處于高滲透壓環(huán)境中，脫去細胞內大量的水分，因此小肽的功能有幾種可能：①與細胞在高度失水狀態(tài)下維持細胞正常的生理活動有關；②是細胞內作為將來供胚胎萌發(fā)用的營養(yǎng)和能量來源的貯藏蛋白；③為細胞分裂生長和胞內物質合成提供能量的能量轉化的功能蛋白，如ATP合成酶。ATP8亞基蛋白是ATP合成酶F0部分的一個組成部分，是跨膜蛋白，和其他的幾個亞