豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及免疫原性分析.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是一種急性、高度接觸性傳染病,以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水為特征,各種年齡的豬只都可以發(fā)病,5周齡以下仔豬的病死率最高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大的損失。TGE的病原體為豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus ofswine,TGEV),該病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員。在眾多對TGEV研究的基礎(chǔ)上,本研究就TGEV

2、在豬睪丸細(xì)胞(ST)上的增殖特點(diǎn)的認(rèn)識、花青素體外抗TGEV的試驗研究、TGEV纖突糖蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及免疫原性分析三個部分對TGEV展開研究。
　　 第一部分:豬傳染性胃腸炎病毒的增殖特點(diǎn)的認(rèn)識。
　　 本試驗復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)了TGEV宿主細(xì)胞-ST,測定TGEV的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染劑量(TCID50),以便于病毒感染毒性的定量,顯微鏡下觀察TGEV吸附ST細(xì)胞后引起的細(xì)胞病變現(xiàn)象,免疫過氧化物酶單層試驗(IP

3、MA)進(jìn)一步認(rèn)識TGEV的增殖規(guī)律。細(xì)胞病變觀察結(jié)果顯示,TGEV侵染ST細(xì)胞后可引起具有“種”的特異性的細(xì)胞病變,引起細(xì)胞核變形或碎裂,甚至導(dǎo)致細(xì)胞的完全破壞,IPMA證明TGEV蛋白質(zhì)的合成在胞漿內(nèi)。
　　 第二部分:花青素體外抗豬傳染性胃腸炎病毒的試驗研究。
　　 在已測定TGEV的TCID50的基礎(chǔ)上,利用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方法,具體研究了花青素對ST細(xì)胞的毒性及花青素對TGEV的直接滅活、治療作用。結(jié)果表明:花青素

4、在ST細(xì)胞上最大安全濃度為0.002g/ml(純度5％),即1mg/ml為實際花青素的最大安全濃度；花青素在ST細(xì)胞上對抗TGEV的最佳用量為0.002g/ml500μl；起到治療作用的花青素用量為0.002g/ml500μl、375μl,但是花青素只是在ST細(xì)胞感染TGEV一定時間內(nèi)對該病毒起到了治療作用,而且體外試驗結(jié)果不能完全等同于體內(nèi)的治療效果,所以體內(nèi)抗病毒效果有待于進(jìn)一步試驗加以驗證。
　　 第三部分:豬傳染性胃腸炎

5、病毒纖突糖蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及免疫原性分析。
　　 根據(jù)GenBank上豬傳染性胃腸炎病毒纖突糖蛋白S全基因序列設(shè)計一對引物,并在5’引物和3’引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn),經(jīng)PCR擴(kuò)增出長2.2kb的目的基因S(其中包含A、B、C、D四個主要抗原位點(diǎn)),克隆于pBS-T載體,克隆載體TS經(jīng)EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切,S基因與pPIC9k載體連接,測序驗證陽性克隆,SalⅠ線性化重組穿梭質(zhì)粒pPIC9k-S,電

6、轉(zhuǎn)化GS115感受態(tài),G418篩選和PCR鑒定得到陽性重組子,1％甲醇誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)后上清經(jīng)SDS-PAGE電泳、免疫印跡和薄層凝膠掃描分析,并利用離子交換技術(shù)和膜超濾方法純化目的蛋白,將純化后的蛋白免疫兩周齡BALB/c小鼠。SDS-PAGE電泳表明,S蛋白以可溶性形式分泌表達(dá)于胞外,且表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為82000,與理論推測的分子量一致。免疫印跡結(jié)果證明,S蛋白可被TGEV豬陽性血清識別,且具有良好的免疫原性。純化蛋白免疫小鼠后,