TGEV感染PK-15細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機制.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染引起的以仔豬嚴(yán)重腹瀉、脫水、嘔吐為主要臨床特征的高度接觸性傳染病。該病最早于1946年在美國確認(rèn)，目前已在多個國家廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。早期的報道顯示，TGEV作為一種腸道冠狀病毒，能夠誘導(dǎo)高水平的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，同時也引起腸

2、道組織的炎性損傷，鈉、鉀離子嚴(yán)重失衡，進而導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重腹瀉脫水致死。這提示我們該病毒與宿主天然免疫應(yīng)答密切相關(guān)，炎癥反應(yīng)在其致病性方面扮演著十分重要的角色。然而，目前對該病毒如何介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答引起宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制知之甚少。因此，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了TGEV與宿主細胞蛋白之間的互作，并且對TGEV感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制進行了研究。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.TGEV感染PK-15細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究為了

3、了解TGEV感染對宿主細胞蛋白表達的影響，利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ）技術(shù)，配合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，對TGEV感染PK-15細胞的蛋白表達情況進行了檢測和分析。共鑒定出162個差異表達的蛋白，包括60個表達上調(diào)的蛋白和102個表達下調(diào)的蛋白。隨后利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異表達蛋白的亞細胞定位、生物學(xué)進

4、程聚類進行了分析，并繪制了互作網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白與細胞周期、細胞的生長與分化及天然免疫反應(yīng)等多種生物進程相關(guān)。并且上調(diào)倍數(shù)位居前列的9個蛋白均與Ⅰ型干擾素信號通路(interferon signaling pathway)，尤其是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1（signal transducer and activator of transcription1，STAT1）以及8種重要的干擾素刺激基因（interferon stimul

5、ated genes，ISGs）密切相關(guān)。為了驗證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性，進一步通過Western blot或Real-time RT-PCR方法對STAT1和8個ISG的表達進行了檢測，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。為了確定TGEV感染是否激活JAK-STAT1信號通路，對TGEV感染后STAT1的磷酸化情況和亞細胞定位進行了檢測，結(jié)果TGEV感染PK-15細胞后能夠誘導(dǎo)STAT1的磷酸化和轉(zhuǎn)位入核，說明TGEV感染能激活JAK-STAT

6、1信號通路并誘導(dǎo)ISGs的產(chǎn)生。
　　2.TGEV感染激活NF-κB信號通路的分子機制NF-κB是調(diào)控促細胞炎癥因子、趨化因子產(chǎn)生的核心轉(zhuǎn)錄因子，在細胞的炎癥反應(yīng)中扮演著十分重要的角色，本研究對TGEV感染激活NF-κB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制開展了研究。首先，利用NF-κB熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TGEV感染對NF-κB的激活情況，發(fā)現(xiàn)其能顯著增強NF-κB啟動子活性，且與病毒的復(fù)制密切相關(guān)。進一步發(fā)現(xiàn)TGEV感染能夠誘導(dǎo)IκBα的降解，以及

7、促進p65發(fā)生磷酸化和核轉(zhuǎn)移。為了確定NF-κB在TGEV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用，我們使用NF-κB特異性活性抑制劑BAY11-7082處理細胞，結(jié)果抑制NF-κB活性后顯著下調(diào)TGEV誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α、RANTES的表達，但不影響TGEV的復(fù)制。為了確定可能參與介導(dǎo)TGEV激活NF-κB信號通路的模式識別受體與接頭蛋白，利用RNA干擾技術(shù)分別沉默受體蛋白基因RIG-I、MDA5和接頭蛋白基因MAVS、STING的表達

8、，結(jié)果這幾個基因的沉默均能顯著抑制TGEV誘導(dǎo)的p65磷酸化和多種促炎癥細胞因子的表達，說明RLRs介導(dǎo)的信號通路參與TGEV激活NF-κB。
　　3.TGEV感染激活JNK信號通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)MAPK信號通路參與介導(dǎo)細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理病理進程，是機體重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。MAPK能被多種炎性刺激激活，又對炎癥反應(yīng)的發(fā)生進行調(diào)控。因此，對TGEV感染影響MAPK通路進行研究有助于進一步全面了解TGEV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的

9、分子機制。首先，我們對TGEV感染是否激活MAPK通路進行了研究，結(jié)果顯示，TGEV在感染后不同時間點能夠誘導(dǎo)ERK1/2、JNK1/2、p38MAPK三種激酶發(fā)生磷酸化，并且雙熒光素酶實驗顯示TGEV能夠激活下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1。為了進一步確定哪一條通路參與TGEV誘導(dǎo)促炎癥因子的產(chǎn)生，分別使用ERK、JNK、p38 MAPK的特異性抑制劑對細胞進行了處理，結(jié)果顯示當(dāng)JNK1/2的激活受到抑制時能夠顯著降低TGEV誘導(dǎo)的IL-6、IL