豬肌肉生長(zhǎng)抑素前肽基因定點(diǎn)誘變載體的構(gòu)建和功能初步檢測(cè).pdf

1、肌肉生長(zhǎng)抑素（Myostatin，MSTN）又稱為生長(zhǎng)分化因子8（GDF-8），是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族的重要成員，在調(diào)節(jié)動(dòng)物肌肉含量上發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，因此，在醫(yī)學(xué)治療和畜牧業(yè)生產(chǎn)中，具有拮抗MSTN功能的生物因子有著良好的應(yīng)用前景和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。MSTN前體經(jīng)體內(nèi)蛋白酶水解后，產(chǎn)生N端的前肽分子和C端包含110個(gè)氨基酸殘基的活性分子。前肽分子通過(guò)與C端二聚體以非共價(jià)鍵結(jié)合抑制后者的生物學(xué)活性，是MSTN天然的拮抗分子。此

2、外，當(dāng)MSTN前肽第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔―76A）后，在體內(nèi)能抵抗BMP-1/TLD金屬蛋白酶的特異性切割作用，從而更有效地抑制C端二聚體的活性。
　　 本研究首先克隆了通城豬含有第一個(gè)內(nèi)含子的MSTN前肽基因，構(gòu)建了真核定點(diǎn)誘變載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞驗(yàn)證了載體表達(dá)的有效性。以通城豬血液樣品中提取的DNA作為模板，PCR擴(kuò)增得到含第一個(gè)內(nèi)含子的MSTN前肽基因，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。再將目的片段定向克隆到去除了

3、EGFP基因的pEGFP-N1表達(dá)載體中。通過(guò)定點(diǎn)誘變方法將前肽編碼序列第76位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔@得了定點(diǎn)誘變載體pEGFP（-）-N1-ProMstnD76A，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞。48h后，通過(guò)RT-PCR和Real-time PCR方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果表明：本研究成功克隆了通城豬含第一個(gè)內(nèi)含子的MSTN前肽基因，并對(duì)該基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變修飾，構(gòu)建了真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染后其前體mRNA能在C2C12

4、細(xì)胞中進(jìn)行正確剪接，目的基因mRNA表達(dá)水平較高。本研究為豬MSTN前肽基因在體內(nèi)表達(dá)的研究奠定基礎(chǔ)，為MSTN前肽轉(zhuǎn)基因豬的制備提供了有用的基因分子材料。
　　 利用GST融合表達(dá)系統(tǒng)高效、快速地表達(dá)重組目的蛋白，本研究獲得了高純度的野生型和定點(diǎn)誘變型豬MSTN前肽蛋白分子，并初步驗(yàn)證了其生物學(xué)活性。將大小為678bp的野生型和定點(diǎn)誘變型豬MSTN前肽cDNA片斷插入到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1的多克隆位點(diǎn)中，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

5、E．coli BL21后，在誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG終濃度為1mM下誘導(dǎo)表達(dá)6h。
　　 結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物融合蛋白GST-ProM和GST-ProMD76A主要以包涵體形式存在，融合蛋白經(jīng)蛋白變性、復(fù)性后，利用GSTrapTMFF親合層析柱進(jìn)行純化。在PreScission蛋白酶作用下，特異性切除融合蛋白N端GST標(biāo)簽蛋白，獲得了純化的重組蛋白ProM（SP-）和ProM（SP-）D76A。從1L菌液中分別獲得4.4mg和4