人內(nèi)皮抑素小環(huán)載體的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、研究背景及目的 非病毒載體不能在基因治療中被廣泛應(yīng)用的一個(gè)主要原因是目的基因的短暫表達(dá)。Chen等的研究發(fā)現(xiàn)即使質(zhì)粒DNA沒(méi)有丟失，也只能短暫表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。最新的研究表明，外源基因表達(dá)盒與細(xì)菌質(zhì)粒骨架之間的共價(jià)連接會(huì)導(dǎo)致外源基因的沉默，這是造成質(zhì)粒載體所攜帶的外源基因在體內(nèi)只能瞬時(shí)表達(dá)的主要原因，也是質(zhì)粒載體臨床應(yīng)用的主要限制因素。 小環(huán)DNA(minicircleDNA)載體是一種自1997年發(fā)展起來(lái)的新型的基因載體

2、，該載體所攜帶的外源基因的表達(dá)盒以環(huán)狀超螺旋的形式存在。與常用的非病毒載體——質(zhì)粒載體相比，小環(huán)DNA載體僅由外源基因的表達(dá)盒構(gòu)成，不含有來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒的骨架結(jié)構(gòu)，從而減少了未甲基化的CpG所致的炎性反應(yīng)，提高了安全性；而堿基數(shù)的減小，更有效的提高了目的基因的表達(dá)和生物利用度。小環(huán)DNA載體克服了質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染率低、易引起免疫反應(yīng)及外源基因在體內(nèi)表達(dá)時(shí)間短的缺點(diǎn)，是一種安全、高效的新型載體。 最初的小環(huán)載體需經(jīng)體外酶切線(xiàn)性化細(xì)菌骨架

3、、氯化銫密度梯度離心以獲得純化的小環(huán)DNA。小環(huán)純化方法的復(fù)雜性增加了大規(guī)模制備的困難，限制了其在臨床上的應(yīng)用。Chen等在2003年構(gòu)建的小環(huán)載體系統(tǒng)采用源于鏈霉菌溫和噬菌體的φc31整合酶，并在母體質(zhì)粒上插入內(nèi)切酶I-SceI的表達(dá)盒。φc31整合酶在宿主菌內(nèi)完成重組過(guò)程后，誘導(dǎo)I-SceI的表達(dá)，可將環(huán)狀骨架及少量未重組的母體質(zhì)粒消化成為線(xiàn)性DNA，繼而在細(xì)菌核酸外切酶的作用下降解，小環(huán)DNA可以從細(xì)菌中一步獲得，毋需進(jìn)一步純化，

4、產(chǎn)率高，有利于大規(guī)模制備。 Folkman等提出腫瘤的生長(zhǎng)是血管依賴(lài)性的，因此抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)是治療腫瘤的一個(gè)有效策略。內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostatin，ES)，是1997年0’Reilly和Folkman在患血管內(nèi)皮瘤的小鼠血清中分離得到的一種血管生成抑制因子，分子量為20kDa，由膠原蛋白ⅩⅧ的C-末端膠原區(qū)內(nèi)的184個(gè)氨基酸片段構(gòu)成，能特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不影響其它非內(nèi)皮系統(tǒng)起源的細(xì)胞。在內(nèi)源性血管生成抑

5、制劑中，內(nèi)皮抑素有最廣泛的抗腫瘤譜，它所靶向的血管生成調(diào)節(jié)基因占基因組的12％。內(nèi)皮細(xì)胞抑制素通過(guò)上調(diào)與血管生成抑制相關(guān)的基因，下調(diào)與血管生成促進(jìn)相關(guān)的基因而對(duì)血管生成的多條信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。 目前有關(guān)小環(huán)DNA的研究?jī)H限于構(gòu)建和純化方法的研究，尚無(wú)攜帶內(nèi)皮抑素治療腫瘤的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在采用含有φc31整合酶的質(zhì)粒pφC31，構(gòu)建表達(dá)人內(nèi)皮抑素的小環(huán)DNA載體，并與普通質(zhì)粒在體外培養(yǎng)真核細(xì)胞和動(dòng)物模型中的表達(dá)效率和表達(dá)時(shí)間進(jìn)行比

6、較；并觀(guān)察其對(duì)裸鼠鼻咽癌移植瘤的抑制作用。 方法從pcDNA3.1(+)中分別擴(kuò)增Pcmv和BGHpolyA片段，定向克隆于pSP72中，構(gòu)建成pSP72-Pcmv-BGHpolyA。將從pSP72-hEndostatin-IRES-EGFP中酶切得到的hEndostatin-IRES-EGFP克隆到pSP72-Pcmv-BGHpolyA，構(gòu)建成pSP72-Pcmv-hEndostatin-IRES-EGFP-BGHpolyA(

7、pSP72-hES)。將pSP72-hES中的整個(gè)表達(dá)框亞克隆至pφC31構(gòu)建母環(huán)質(zhì)粒pφ-hES。pφ-hES在含阿拉伯糖的LB培養(yǎng)液中，32℃誘導(dǎo)φC31整合酶介導(dǎo)的分子內(nèi)重組，產(chǎn)生一個(gè)只含目的基因表達(dá)盒的小環(huán)和一個(gè)含有細(xì)菌骨架的小質(zhì)粒。繼而在37℃激活I(lǐng)-SceI酶降解閉環(huán)的細(xì)菌骨架后，抽提獲取小環(huán)mc-hES。 將hEndostatin-IRES-EGFP片段亞克隆至pcDNA3.1載體構(gòu)建endostatin的普通真核

8、表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-hES作為研究的對(duì)照。 將mc-hES、pφ-hES、pcDNA-hES分別轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞48小時(shí)后，通過(guò)RT-PCR和Westernblot觀(guān)察其表達(dá)。MTT法檢測(cè)endostatin對(duì)HUVEC的增殖抑制作用。建立CNE2裸鼠移植瘤模型，觀(guān)察mc-hES和pcDNA-hES的抑瘤活性。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)mc-hES介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)的長(zhǎng)期表達(dá)。免疫組化檢測(cè)內(nèi)皮抑素在腫瘤組織中的表達(dá)。 結(jié)果經(jīng)DN

9、A測(cè)序表明構(gòu)建的pφ-hES、mc-hES、pcDNA-hES序列正確，轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞后，均有EGFP和人內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)。在相同情況下，小環(huán)DNA載體的轉(zhuǎn)染效率和目的基因表達(dá)強(qiáng)度均優(yōu)于傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體。MTT顯示endostatin抑制HUVEC的增殖，而對(duì)CNE2無(wú)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示：小環(huán)組腫瘤體積明顯小于空質(zhì)粒對(duì)照組和pcDNA-hES組。mc-hES組較pcDNA-hES組能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果

10、顯示小環(huán)組在體內(nèi)可以表達(dá)內(nèi)皮抑素蛋白20天以上，而pcDNA-hES對(duì)照組則在第7天時(shí)就已經(jīng)很弱，在第14天時(shí)就檢測(cè)不到內(nèi)皮抑素的表達(dá)。mc-hES、pcDNA-hES、空質(zhì)粒組抑瘤率分別為46.42％、15.8％、1.8％，小環(huán)組較pcDNA-hES組有顯著性差異，生理鹽水組和空載體組無(wú)顯著性差異。 結(jié)論1成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pφ-hES、mc-hES、pcDNA-hES，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后在mRNA和蛋白水平證實(shí)有hEndos

11、tatin和EGFP的表達(dá)，且在相同情況下，小環(huán)組明顯高于其他兩組。 2內(nèi)皮抑素能特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而對(duì)鼻咽癌細(xì)胞無(wú)抑制作用。內(nèi)皮抑素對(duì)腫瘤的抑制作用是通過(guò)抑制腫瘤血管的形成而起作用的。 3mc-hES在一次給藥后，較pcDNA-hES能明顯抑制裸鼠鼻咽癌移植瘤的生長(zhǎng)，長(zhǎng)期高效表達(dá)內(nèi)皮抑素蛋白，達(dá)20天之久，明顯長(zhǎng)于普通質(zhì)粒。 4小環(huán)較普通質(zhì)粒更能長(zhǎng)期、高效的介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，是一種較為理想的基因治療的