抗菌肽CAP18的規(guī)?；磉_(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè).pdf

1、抗菌肽是宿主防御系統(tǒng)抵御外源細(xì)菌感染的一個(gè)有力武器，它們能通過(guò)直接攻擊微生物的膜表面而抑制微生物的生長(zhǎng)，是一種最具潛力的抗生素替代品。本研究的目的是通過(guò)基因優(yōu)化技術(shù)，采用SOE法合成c-CAP18基因，完成抗菌肽在復(fù)合自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，并檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的體內(nèi)外抑菌和抗病毒活性，為規(guī)模化生產(chǎn)和最終臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 根據(jù)CAP18活性片段氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏嗜性，采用SOE技術(shù)，設(shè)計(jì)合成了CAP

2、106-142的編碼基因，命名為c-CAP18，將其定向克隆至原核表達(dá)載體pET-32a的多克隆位點(diǎn)，獲得含有1~8個(gè)片段的串聯(lián)多聚體表達(dá)載體，命名為p-c-CAP18Ⅰ-Ⅷ，完成了p-c-CAP18Ⅰ-Ⅷ重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21 (DE3) 中的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在30℃、OD600菌密度1.0、IPTG濃度0.8 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為8 h的條件下，含有雙拷貝的p-c-CAP18Ⅱ重組質(zhì)粒能獲得高水平的表達(dá)，融合蛋白表達(dá)量達(dá)

3、到0.788 g/L。
　　 為了選擇適合于放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，使用了本研究小組發(fā)明的復(fù)合自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（CAI-4），進(jìn)行p-c-CAP18Ⅱ的發(fā)酵培養(yǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，重組質(zhì)粒p-c-CAP18Ⅱ在CAI-4中獲得了大量的表達(dá)，融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到11.104 g/L，與LB培養(yǎng)基（條件優(yōu)化后）相比，表達(dá)量提高了14倍。發(fā)酵罐的規(guī)模培養(yǎng)結(jié)果表明，可溶蛋白表達(dá)量可達(dá)到9.788 g/L，占總可溶蛋白的62.3％。融合蛋白經(jīng)Ni2+

4、親和層析后采用溴化氰對(duì)其進(jìn)行化學(xué)切割，選擇雞大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、產(chǎn)單孢李氏桿菌(L.monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)為供試菌種，以氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素以及人工合成的CAP18106-142活性片段為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照組，測(cè)定c-CAP18融合蛋白樣品的體外抗菌活性。結(jié)果表明，培養(yǎng)18 h后4種細(xì)菌菌密度分別為0.03525、0.0353

5、、0.07514和0.03046，與人工合成的CAP18106-142活性片段陽(yáng)性對(duì)照0.02789、0.0271、0.02426和0.02968相當(dāng)，而與陰性對(duì)照0.8905、0.8385、0.8和0.77差異顯著（P<0.01）。
　　 選用9-11日齡SPF雞胚15枚，隨機(jī)分成3組，先通過(guò)尿囊腔接種H3N2亞型豬流感病毒0.1 mL（106EID50/枚），37℃孵育l h后，選取兩組分別接種人工合成的抗菌肽CAP18和c

6、-CAP18融合蛋白0.2 mg/枚，另1組為空白對(duì)照，96 h后收獲病毒液，測(cè)定其血凝價(jià)。結(jié)果表明，培養(yǎng)96小時(shí)后，c-CAP18融合蛋白組的平均病毒滴度為106.83，與合成多肽組（病毒滴度106.5）相當(dāng)，而與空白對(duì)照組（病毒滴度為108.125）差異顯著（P<0.05）
　　 同時(shí)為了檢測(cè)其體內(nèi)抑菌抗病毒活性，選用6-8周齡的雄性Balb/C小鼠45只，隨機(jī)分為9組，每組5只，其中3組接種大腸桿菌(E.coli)，3組接

7、種金黃色葡萄球菌(S.aureus)，接種菌量均為2×106CFU/只，3組接種H3N2亞型豬流感病毒，接毒劑量為106EID50/只。3天后從接種大腸桿菌組和金黃色葡萄球菌組各選出2組分別經(jīng)鼻腔服用卡那霉素和c-CAP18融合蛋白，均為0.2 mg/只/天，另2組為陰性對(duì)照，從接種H3N2亞型豬流感病毒組選出2組，分別經(jīng)鼻腔途徑服用人工合成的c-CAP18活性片段和c-CAP18融合蛋白，均為0.2 mg/只/天，另1組為陰性對(duì)照，連

8、續(xù)給藥3天，觀察1周。1周后從每組各取2只小鼠，采集病料進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)和病毒血凝價(jià)的測(cè)定。結(jié)果表明，兩種細(xì)菌最高菌落數(shù)分別為2.41×107和1.41×107，與陽(yáng)性對(duì)照組1.08×107和0.99×107相當(dāng)，而與陰性對(duì)照組4.33×107和2.08×107差異顯著（P<0.05）；心、肝、脾、肺和大腸各組織病毒血凝價(jià)分別為104.3、103.6、104.3、104.6和104.6，與合成多肽組103.6、103.3、103.6、104