聚肌胞合成條件的優(yōu)化及其抗病毒作用的研究.pdf

1、聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid，polyI:C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通過堿基互補配對形成的雙鏈RNA，是一種高效干擾素誘導劑。本研究利用國產原料首先對聚肌胞的合成條件進行了優(yōu)化，探討了影響聚肌胞結構穩(wěn)定性的因素。為探討聚肌胞對特異性免疫的影響，本文研究了新城疫免疫前后不同時間應用聚肌胞對雛雞抗體水平的影響。為探討聚肌胞在魚類中的抗病毒作用，研究了聚肌胞對患有淋巴囊腫病毒病牙鲆的初步療效;探討了聚

2、肌胞的抗病毒機制，實驗進一步對聚肌胞不同用藥途徑誘導大菱鲆抗病毒蛋白Mx轉錄水平的時相變化以及血液天然免疫相關指標的變化進行了較深入的研究。研究結果如下:
　　 1.聚肌苷酸與聚胞苷酸合成聚肌胞的最適條件為:磷酸緩沖液(pH7.2)或Tris-HCl緩沖液(pH7.2)可以提供聚肌胞穩(wěn)定的pH環(huán)境，聚肌苷酸和聚胞苷酸在45℃條件下退火，并在100℃煮沸滅菌30min后采取水流迅速降溫復性形成的聚肌胞減色效應顯著，適當增加金屬離子

3、(Na+，Ca2+)溶液的濃度可以增強聚肌胞結構的穩(wěn)定性。聚肌苷酸受Na+的影響顯著并且可以被溴化乙啶染色，表明聚肌苷酸溶液具有自身可以配對形成雙鏈的結構特點;聚胞苷酸不具備雙鏈結構的特點;Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Na+在一定濃度范圍內可以明顯提高聚肌胞雙鏈的結合緊密度，而Cu2+對聚肌胞雙鏈結構具有破壞作用;硫酸卡那霉素和鈣離子可以保護聚肌胞抵抗RNA酶迅速降解的作用;實驗發(fā)現(xiàn)了不同動物的血清中RNA酶活性對聚肌胞的降

4、解作用有差異，其中，雞血清對聚肌胞的降解最明顯，而兔血清對聚肌胞降解不明顯;聚肌胞的瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，聚肌胞的遷移率與100bp的Marker基本一致，Ca2+和硫酸卡那霉素對聚肌胞的電泳遷移率沒有影響。聚肌胞的性質及其穩(wěn)定性的研究為開發(fā)價廉有效的新型抗病毒藥物提供了工藝參數(shù)基礎。
　　 2.聚肌胞聯(lián)合新城疫疫苗可以提高雛雞血清中的免疫抗體滴度。免疫之前48h、24h和12h注射polyI:C，雛雞血液中抗體效價僅在10日齡明

5、顯升高;免疫新城疫疫苗的同時及免疫之后12h、24h注射polyI:C，9～12日齡雛雞血清抗體滴度均明顯提高。PolyI:C可以提高雛雞免疫抗體滴度，對由弱毒苗刺激的免疫反應具有調理作用。實驗結果為干擾素誘導劑與弱毒疫苗的聯(lián)合應用提供了重要的試驗參考。
　　 3.本研究利用聚肌胞對患有淋巴囊腫病毒病的牙鲆進行了初步治療，發(fā)現(xiàn)聚肌胞能夠抑制淋巴囊腫病毒復制。聚肌胞對輕度患病牙鲆治療的10日內發(fā)現(xiàn)，僅1尾牙鲆死亡，其中10尾魚的較

6、大腫瘤有明顯脫落現(xiàn)象;而對患病較重的牙鲆治療后發(fā)現(xiàn)，囊腫脫落效果不明顯，但囊腫也不增多，死亡率為16％左右，對照組死亡率達到40％。對患有淋巴囊腫病毒病的牙鲆組織器官的石蠟切片顯示，囊腫塊內具有明顯的肥大細胞;在肉瘤根部的上皮組織內發(fā)現(xiàn)了許多比正常上皮細胞大數(shù)十倍的肥大細胞;鰓絲部位有明顯顆粒狀聚集體，疑似病毒包涵體聚集體。本實驗首次使用聚聚肌胞在水產養(yǎng)殖上進行臨床應用，并取得了一定的治療效果，這將為困擾了水產業(yè)多年的病毒病的治療提供依

7、據(jù)。
　　 4.聚肌胞腹腔注射，浸泡和投喂等三種用藥方式對大菱鲆血清中的堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性有一定的影響，對血清溶菌酶活性的影響不顯著，注射聚肌胞后大菱鲆血液細胞中的白細胞比例有升高趨勢，但與用藥前相比差異不顯著。在分子水平上，本試驗利用軟件對大菱鲆Mx基因進行了分析，利用Mx基因保守區(qū)自行設計的引物擴增片段特異性較高，初步建立了半定量RT-PCR法檢測Mx基因的表達;三種用藥途徑誘導Mx轉錄水平的時相變化發(fā)現(xiàn)，三種途徑均