聚肌胞體內(nèi)外抗病毒活性、毒性研究及其微囊的制備與評價(jià).pdf

1、聚肌胞（polyinosinic:polycytidylic acid copolymer,Poly I:C）是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物,是一種高效的干擾素(IFN)誘生劑,具有廣譜抗病毒、刺激吞噬、調(diào)整機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗某些細(xì)菌和原蟲感染等功能。目前Poly I:C的應(yīng)用報(bào)道多集中在人類醫(yī)學(xué)上用于治療肝炎、皰疹病毒感染及一些腫瘤性疾病等方面,顯示了其確實(shí)的臨床療效。雖然Poly I:C在獸醫(yī)臨床中也有治療豬瘟、鴨瘟等疾病的報(bào)道,但

2、與此相關(guān)的資料卻十分鮮見,更缺乏深入的研究。本文對Poly I:C體內(nèi)外抗病毒活性及毒性作用進(jìn)行了研究,并為解決Poly I:C價(jià)格昂貴,在體內(nèi)容易被血清酶降解及注射使用易造成應(yīng)激反應(yīng)等限制其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中使用的問題,制備了具有緩慢釋放作用的Poly I:C微囊并對其進(jìn)行了體內(nèi)外效果評價(jià)。
　　 Poly I:C對離體培養(yǎng)雞胚CEF細(xì)胞的抗病毒活性研究為探討Poly I:C的抗病毒效果及其機(jī)理,選擇雞新城疫病毒（Lasota株）

3、和水皰口炎病毒(vsv)對離體培養(yǎng)的雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞進(jìn)行病毒感染,分別研究Poly I:C對離體培養(yǎng)雞胚CEF細(xì)胞的病毒抑制和干擾素測定試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明,Poly I:C能顯著抑制NDV在CEF細(xì)胞上生長,但Poly I:C對NDV的抑制作用并非隨著其劑量的增加和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng),60μg/mL的PolyI:C在CEF細(xì)胞上作用12h后,產(chǎn)生的抗病毒活性最強(qiáng)；PolyI:C抑制水皰口炎病毒在CEF細(xì)胞上生長的結(jié)果表明,Po

4、ly I:C具有免疫刺激活性,Poly I:C能誘導(dǎo)IFN-a mRNA和IFNβmRNA轉(zhuǎn)錄水平升高,說明Poly I:C的抗病毒作用和其誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素有關(guān)；而且IFN-βmRNA轉(zhuǎn)錄水平是IFN-a mRNA表達(dá)量的數(shù)倍,說明IFlN-β在抗病毒活性中起主要作用；然而,Poly I:C也同時(shí)能抑制CEF細(xì)胞的生長,且與Poly I:C劑量和作用時(shí)間成正比,說明Poly I:C具有一定的毒副作用,在臨床使用時(shí),應(yīng)注意使用劑量和使用頻

5、度.
　　 Poly l:C對感染NDV的雞胚和肉雞的抗病毒活性研究為探討Poly I:C在體內(nèi)的抗病毒效果,本研究通過Poly I:C對感染NDV的SPF雞胚和肉雞進(jìn)行了體內(nèi)病毒抑制試驗(yàn).SPF雞胚體內(nèi)病毒抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示,5 mg-mL-1的Poly I:C溶液（0.1 mL/枚）能明顯抑制NDV在SPF雞胚中的繁殖,減輕NDV對雞胚生長的抑制作用,降低病毒血凝價(jià)和雞胚死亡數(shù)；Poly I:C對內(nèi)雞抵抗NDV感染的試驗(yàn)結(jié)果顯

6、示,注射0.02 mg/kg.bw,0.01 mg/kg.bw和0.005 mg/kg'bw的Poly I:C后,肉雞死亡率分別為40％、20％和26.7％,均極顯著低于攻毒對照組的63.3％(P<0.01).
　　 Poly I:C誘導(dǎo)雞胚CEF細(xì)胞凋亡的研究為研究Poly I:C對CEF細(xì)胞的毒性及其機(jī)理,將Poly I:C與CEF細(xì)胞共孵育后,對CEF細(xì)胞活性、形態(tài)變化、磷脂酰絲氨酸外翻、DNA片段形成、caspase-3

7、,caspase-8,easpase-9活性變化及RIPKl mRNA和TNFRSF8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平等進(jìn)行檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著Poly I:C藥物濃度和作用時(shí)間的延長,CEF細(xì)胞活性降低,成劑量和時(shí)間正相關(guān),表明Poly I:C對CEF細(xì)胞具有一定的毒性作用；磷脂酰絲氨酸外翻和DNA片段形成顯示,Poly I:C可誘導(dǎo)CEF細(xì)胞的凋亡；隨著作用時(shí)間的延長,easpase-3活性升高,說明Poly I:C引起的凋亡和caspaps

8、e激活途徑相關(guān)；caspase-8活性升高,而easpase-9活性沒有顯著變化的結(jié)果說明Poly I:C誘導(dǎo)凋亡和死亡受體途徑相關(guān)；TNFRSF8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增加說明凋亡和TNFRSF8上調(diào)有關(guān)。
　　 Poly l:C微囊的制備與體外評價(jià)以乙基纖維(EC)為囊材,采用液中干燥法制備Poly I:C緩釋微囊。通過正交實(shí)驗(yàn)對成囊試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)結(jié)果表明,700 rpm轉(zhuǎn)速、0.4g硬脂酸鎂、2％司盤-80、囊材占丙酮

9、質(zhì)量2.5％、丙酮和石蠟體積比30：30為最佳制備條件。對最佳條件制備的微囊進(jìn)行體外試驗(yàn)評價(jià),微囊大小均一,平均粒徑93.56μm,載藥率為0.64％,包封率為74％,體外釋放度隨著聚乙二醇-2000(PEG-2000)的含量增加而增大。
　　 Poly I:C微囊對NDV感染肉雞IFN-α及免疫活性的誘導(dǎo)效應(yīng)為了評價(jià)口服型Poly1:C微囊抗病毒的效果及其與注射型Poly I:C的療效差異,本文通過給新城疫病毒(NDV)感染肉

10、雞口服Poly I:C微囊,測定了人工感染NDV肉雞體內(nèi)α-干擾素(IFN-α)和反映機(jī)體免疫活性狀態(tài)的特異性和非特異性免疫功能指標(biāo)。結(jié)果顯示,口服型Poly1:C微囊所呈現(xiàn)的治療效果與其注射型可產(chǎn)生相同的誘導(dǎo)IFN-α的能力,說明Poly I:C微囊在內(nèi)服吸收過程中,受到消化道中核苷酸酶降解的程度并不顯著；一定劑量范圍內(nèi),Poly I:C誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α的能力與劑量成正比,但超過一定劑量范圍(0.2 mg/kg.bw)則可能產(chǎn)生抑制