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1、褐飛虱Nilaparvatalugens、灰飛虱Laodelphaxstriatellus和白背飛虱Sogatellafurcifera,屬同翅目飛虱科(Homoptera:Delphacidae),是我國(guó)水稻上的最重要害蟲(chóng);稻田生態(tài)系統(tǒng)中,捕食性天敵的種類(lèi)和數(shù)量非常豐富,在控制稻飛虱為害方面起著重要的作用;明確捕食性天敵種類(lèi)以及各種捕食性天敵對(duì)稻飛虱控制作用的大小是充分發(fā)揮天敵控制作用的基礎(chǔ)和前題。本研究通過(guò)PCR克隆得到白背飛虱、褐
2、飛虱和灰飛虱的ITS基因序列,設(shè)計(jì)合成了三種飛虱的引物和特異性ALLGlo探針,建立優(yōu)化了ALLGlo探針三重實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)體系和方法,并應(yīng)用該方法對(duì)稻田常見(jiàn)捕食性天敵對(duì)稻飛虱的捕食作用進(jìn)行了研究。獲得的主要結(jié)果如下: 1.利用PCR方法克隆了白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基(COI)基因和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域(ITS1和ITS2)基因,三種飛虱的COI,ITS1和ITS2基因序列分析表明:COI,ITS1和IT
3、S2在白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱種間的相似性分別為89.02%,67.98%和70.11%. 2.利用白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的ITS2基因序列,設(shè)計(jì)合成了一對(duì)這三種飛虱特有的引物,該引物不與稻田其它主要害蟲(chóng)、天敵和中性昆蟲(chóng)基因組DNA發(fā)生擴(kuò)增作用,具有這三種稻飛虱的特異性;該引物對(duì)白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱基因組DNA的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為192,215和207bp;利用該引物建立了多重PCR體系,該體系可定性檢測(cè)捕食性天敵消化道內(nèi)
4、殘留的飛虱基因組DNA。 3.根據(jù)ALLGlo探針設(shè)計(jì)原則,選取白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的ITS2基因序列,利用PrimerExpress2.0軟件,設(shè)計(jì)合成了白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱引物和特異性ALLGlo探針;通過(guò)調(diào)整引物、探針、dNTP和酶濃度,建立優(yōu)化了三重實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)體系。該體系僅與這三種稻飛虱發(fā)生反應(yīng),具有高度的特異性,該三重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)體系對(duì)白背飛虱標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的靈敏度為100個(gè)拷貝,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.8251g
5、x+45.391,R2=0.99,擴(kuò)增效率為182.57%,動(dòng)態(tài)范圍為l02~107;褐飛虱標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的靈敏度為1000個(gè)拷貝,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.7821gx+43.786,R2=0.98,擴(kuò)增效率為183.82%,動(dòng)態(tài)范圍為l03~107;灰飛虱標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的靈敏度為100個(gè)拷貝,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.6481gx+42.898,R2=0.99,擴(kuò)增效率為187.98%,動(dòng)態(tài)范圍為l02~107。干擾實(shí)驗(yàn)證明,將不同模板按不同濃度組合,當(dāng)兩
6、種飛虱模板濃度即使相差10000倍時(shí),低濃度的質(zhì)粒DNA仍然能夠檢測(cè)到,并且具有很高的相關(guān)性,決定系數(shù)R2達(dá)到0,99以上;同時(shí),捕食者基因組DNA對(duì)獵物DNA的多重實(shí)時(shí)定量PCR不存在抑制作用或降低擴(kuò)增效率。 4.定量檢測(cè)結(jié)果表明單頭白背飛虱長(zhǎng)翅雌蟲(chóng)目標(biāo)拷貝數(shù)為111192839,標(biāo)準(zhǔn)差為8873990,變異系數(shù)為7.98%;單頭褐飛虱長(zhǎng)翅雌蟲(chóng)目標(biāo)拷貝數(shù)為860074796,標(biāo)準(zhǔn)差44151965,變異系數(shù)為5.13%;單頭灰
7、飛虱長(zhǎng)翅雌蟲(chóng)目標(biāo)拷貝數(shù)為274680423,標(biāo)準(zhǔn)差為8690453,變異系數(shù)為3.16%。添加回收實(shí)驗(yàn)表明CTAB裂解法提取基因組DNA過(guò)程中目標(biāo)拷貝的平均損失率為10.66%,因此可以用CTAB法提取捕食者消化道內(nèi)殘留的微量獵物基因組DNA。單頭白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱長(zhǎng)翅型雌性成蟲(chóng)在擬環(huán)紋豹蛛消化道內(nèi)的降解曲線分別為:白背飛虱,y=0.548x+21.594,決定系數(shù)R2=0.8744,經(jīng)28h消化后,殘留約1580個(gè)拷貝;褐飛虱y
8、=0.2075x+22.257,決定系數(shù)R2=0.5047,經(jīng)32h消化后,殘留約23870個(gè)拷貝;灰飛虱,y=0.5304x+20.588,決定系數(shù)R2=0.8125,經(jīng)24h消化后,殘留約2710個(gè)拷貝。 5.應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了嘉興單季晚稻田主要捕食性天敵對(duì)白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱的捕食作用。結(jié)果表明,在稻田生態(tài)系統(tǒng)中,白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱有多種共同的捕食性天敵,不同捕食者對(duì)不同獵物的陽(yáng)性反應(yīng)率不同。就白背
9、飛虱而言,八斑球腹蛛陽(yáng)性率最高達(dá)73.64%,最低的黑肩綠盲蝽也達(dá)到34.94%;對(duì)褐飛虱而言,黑肩綠盲蝽陽(yáng)性率最高達(dá)72.06%,最低的為錐腹肖蛸僅有12.71%;對(duì)灰飛虱而言,擬環(huán)紋豹蛛陽(yáng)性率最高達(dá)79.14%,最低的為錐腹肖蛸也達(dá)到44.92%。 6.不同捕食者對(duì)三種稻飛虱獵物留量存在很大差異。在整個(gè)水稻生長(zhǎng)期內(nèi),就白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱來(lái)說(shuō),都是擬環(huán)紋豹蛛消化道內(nèi)獵物平均殘留最高,分別為53600拷貝,13587277
10、拷貝和3829821拷貝。對(duì)白背飛虱黑肩綠盲蝽平均殘留拷貝數(shù)最少,為5214拷貝;對(duì)褐飛虱食蟲(chóng)瘤胸蛛平均殘留拷貝數(shù)最少,為500151拷貝;對(duì)灰飛虱錐腹肖蛸平均殘留拷貝數(shù)最少,為32957拷貝。 7.對(duì)三個(gè)不同調(diào)查時(shí)間的捕食性天敵消化道內(nèi)飛虱殘留種類(lèi)、構(gòu)成進(jìn)行分析。對(duì)于灰飛虱和白背飛虱在7月上前后遷入,褐飛虱在7月下~8月上遷入的遲栽單季晚稻,分蘗末期(8月14日)時(shí)擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛和食蟲(chóng)瘤胸蛛主要以白背飛虱和灰飛虱為主,
11、并且有相當(dāng)高比例的捕食者消化道內(nèi)一種飛虱都沒(méi)有;抽穗期(9月14日)和灌漿期(10月10日)時(shí)擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲(chóng)瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽消化道內(nèi)的獵物種類(lèi)多樣性增加,褐飛虱和灰飛虱成為主要獵物,陽(yáng)性率最高達(dá)100%。同時(shí),消化道內(nèi)三種飛虱殘留都存在的比例也大幅增加,甚至達(dá)到80%。結(jié)果表明,擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲(chóng)瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽對(duì)褐飛虱和灰飛虱的捕食主要受兩種飛虱種群數(shù)量的影響,隨著兩種飛虱種群數(shù)量的增加,擬環(huán)紋豹蛛、八斑球
12、腹蛛、食蟲(chóng)瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽的獵物種類(lèi)和構(gòu)成都相應(yīng)增加。 8.比較同一時(shí)期和不同時(shí)期,不同捕食者對(duì)白背飛虱、褐飛虱和灰飛虱捕食作用殘留量可知:從9月上旬到10月下旬,擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲(chóng)瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽消化道內(nèi)殘留褐飛虱都較高;從8月上旬到9月中旬,擬環(huán)紋豹蛛和八斑球腹蛛消化道內(nèi)殘留灰飛虱較高,9月中旬后,擬環(huán)紋豹蛛、八斑球腹蛛、食蟲(chóng)瘤胸蛛和黑肩綠盲蝽消化道內(nèi)殘留灰飛虱也較高;對(duì)白背飛虱而言,整個(gè)水稻生長(zhǎng)期,這幾種捕食
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