草食動物厭氧真菌及其共存甲烷菌的分離鑒定和體外發(fā)酵特性的初步研究.pdf

1、瘤胃是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，里面棲居著大量的目前還不被人們完全了解的厭氧真菌、古菌、原蟲和真細(xì)菌。這些微生物在瘤胃內(nèi)的能量轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用。甲烷是瘤胃微生物代謝的終產(chǎn)物之一，對動物而言它是能量的損失，對環(huán)境而言是溫室氣體之一，然而對能源而言它又是可燃性氣體，因此瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究越來越受到重視。甲烷菌處于厭氧代謝鏈的最低端，在漫長的歷史進(jìn)化過程中，自然選擇的壓力使它必然與代謝鏈上端微生物密切聯(lián)系。厭氧真菌和甲烷菌之間的種間氫轉(zhuǎn)移，

2、使這兩種微生物緊密聯(lián)系在一起。利用這一關(guān)系，進(jìn)行體外研究厭氧真菌和甲烷菌在瘤胃內(nèi)的實(shí)際關(guān)系將為瘤胃微生物研究提供新的思路。
　　 第一部分：厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物分離純化利用厭氧滾管技術(shù)對6個草食動物來源的樣品進(jìn)行厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物的分離純化。在分離過程中以厭氧真菌菌落為分離參照。結(jié)果表明，在分離純化到的12個共培養(yǎng)物中，有9個培養(yǎng)物含有厭氧真菌和甲烷菌，且產(chǎn)生甲烷，3個培養(yǎng)物存在厭氧真菌但不含產(chǎn)甲烷菌，不產(chǎn)生甲烷。形態(tài)

3、學(xué)觀察和DAPI細(xì)胞核染色初步鑒定顯示，9個產(chǎn)甲烷共培養(yǎng)物中的厭氧真菌及3個不產(chǎn)甲烷培養(yǎng)物中的厭氧真菌分別屬于Piromyces，Anaeromyces和Neocallimastix屬。對產(chǎn)甲烷共培養(yǎng)物中的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行DGGE和16S rRNA基因序列分析顯示，每個共培養(yǎng)物中均僅有一株甲烷菌，并且這9個共培養(yǎng)物中的甲烷菌均屬于甲烷短桿菌。結(jié)論，厭氧真菌和甲烷菌存在密切的共生關(guān)系，通過厭氧滾管技術(shù)可將聯(lián)系緊密的厭氧真菌和產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)物分

4、離純化出來。
　　 第二部分：厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物及純厭氧真菌體外發(fā)酵特性的比較結(jié)果表明：各共培養(yǎng)物發(fā)酵后，干物質(zhì)消失率在33％-49％之間。分離自水牛新鮮糞樣的共培養(yǎng)物12，產(chǎn)氣量（150.2 mL）、甲烷產(chǎn)量（21.4 mL）、干物質(zhì)消失率、木聚糖酶酶活都為最高（P<0.05），而分離自山羊瘤胃液的共培養(yǎng)物F1和F2，其總產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量較菌株12稍低，但生長延滯期較短，發(fā)酵速度快。分離自騾子的兩個共培養(yǎng)物L(fēng)1和L2的總

5、產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量和干物質(zhì)消失率都顯著低于分離自反芻動物的共培養(yǎng)物（P<0.05），但它們之間的酶活相差不顯著（P>0.05）。3個分離自單胃草食動物馬和驢的純厭氧真菌發(fā)酵96 h，總產(chǎn)氣量（僅為64.4 mL，22.1 mL，29.4 mL）及CMCase和木聚糖酶酶活顯著低于厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物的總產(chǎn)氣量（P<0.05）。各共培養(yǎng)物產(chǎn)生的木聚糖酶遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其所產(chǎn)生的CMCase酶活，并且大部分共培養(yǎng)物產(chǎn)生的CMCase酶活差異不顯著

6、（P>0.05）。結(jié)論，不同共培養(yǎng)物發(fā)酵同一底物的能力有顯著差異。
　　 第三部分：厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化木質(zhì)化纖維素生成甲烷的研究對共培養(yǎng)物I2、F1、N3的研究發(fā)現(xiàn)，它們利用不同木質(zhì)化纖維素底物生成甲烷的能力具有相似的趨勢。三個共培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化效率均最高的底物是玉米芯（I2、F1、N3：干物質(zhì)消失率66.39％、64.96％、60.26％；甲烷產(chǎn)量41.4 mL，31.0 mL，32.6 mL）（P<0.05），其次是甘蔗

7、渣、小麥秸稈、玉米桿、小麥麩皮、DDGS，然而這三個共培養(yǎng)物都不利用鋸屑生長。對結(jié)果進(jìn)一步分析顯示，這三個共培養(yǎng)物的總產(chǎn)氣量分別與各自的甲烷產(chǎn)量（R2>0.98）和干物質(zhì)消失率呈線性正相關(guān)（R2>0.90）。此外，I2、F1、N3分泌到培養(yǎng)液中的纖維水解酶酶活，也以玉米芯為最高，其次是甘蔗渣和小麥秸稈（P>0.05）。雖然，培養(yǎng)液上清中的CMCase和木聚糖酶酶活有隨著總產(chǎn)氣量的升高而升高的趨勢，但與總產(chǎn)氣量沒有線性關(guān)系。
　　

8、 第四部分：厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物以及去除甲烷菌的共培養(yǎng)物發(fā)酵特性的研究本試驗(yàn)利用厭氧真菌對氯霉素不敏感的特性去除共培養(yǎng)物中的甲烷菌，研究共培養(yǎng)物以及去除甲烷菌的共培養(yǎng)物的發(fā)酵特性。研究結(jié)果顯示，用氯霉素去除I2、F1、F2、N1、N2、N3、L1、L2中的甲烷菌后，僅有F1、F2、N1、N2、N3中的厭氧真菌存活。對共培養(yǎng)物（F1-A和N3-A）以及去除共培養(yǎng)物中的甲烷菌后獲得的純厭氧真菌（F1-B和N3-B）的進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，