甲烷氧化菌分離鑒定及其對煤樣中甲烷降解能力的研究.pdf

1、甲烷是煤礦瓦斯、煤層氣的主要成分，CH4爆炸極限是4.5-16％，易燃易爆。煤礦瓦斯氣體是影響采煤安全作業(yè)的重要因素，在開采煤礦過程中瓦斯氣體釋放，在井下大量積累，是煤礦事故發(fā)生的重要因素之一。目前主要是采用巷道通風(fēng)，抽放等物理手段處理煤礦瓦斯，但由于煤層地質(zhì)構(gòu)造復(fù)雜，煤層透氣性差，煤礦瓦斯災(zāi)害很難得到徹底的治理。甲烷氧化菌具有分解利用甲烷的能力，為解決煤礦瓦斯問題提供了新的方向。若能在煤層開采作業(yè)面或煤層中利用甲烷氧化菌降低甲烷含量是

2、值得探索的新途徑。甲烷氧化菌氧化甲烷的活性受外界條件影響較大，對環(huán)境溫度、壓力和氧敏感，以及在含瓦斯的煤層中，甲烷是與煤以一種結(jié)合態(tài)的形式存在的，這些問題都是利用甲烷氧化菌治理瓦斯氣體面臨的重要技術(shù)難題。因此篩選高活性、適應(yīng)能力強(qiáng)的甲烷氧化菌菌株、探明甲烷氧化菌吸收和利用煤層中結(jié)合態(tài)甲烷的能力是開展微生物治理瓦斯氣體危害的基礎(chǔ)性工作。本研究在甲烷氧化菌篩選、煤樣中甲烷的微生物降解等方面開展了如下研究工作。
　　從新鄉(xiāng)衛(wèi)河、牧野湖等

3、采集土壤樣，經(jīng)過富集培養(yǎng)、分離得到3株甲烷氧化菌，分別是AEM1204、AEM1235、AEM1296菌株。控制甲烷為唯一碳源對其進(jìn)行氣相色譜鑒定，其中AEM1235利用甲烷能力最強(qiáng)。對pH、溫度等培養(yǎng)條件優(yōu)化，AEM1235菌株最適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為:甲烷氧化細(xì)菌培養(yǎng)基(g/L)∶NH4Cl0.5，K2HPO40.4，KH2PO4·7H2O0.4,MgSO4·7H2O0.3,CaCl2·2H2O0.02,KNO31.6;NaCl0.

4、3,EDTA0.02,FeSO4·7H2O0.004,CuSO4·5H2O0.0013,MnSO4·H2O0.004,ZnSO4·7H2O0.00034,NaMoO4·2H2O0.0024，pH為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃，氣相充入氧氣∶甲烷=1∶1的混合氣體。此外甲烷氧化菌AEM1235也能利用甲醇作為唯一碳源生長，生長速率高于CH4作為唯一碳源。因此在大量培養(yǎng)該甲烷氧化菌時，先用甲醇培養(yǎng)獲得生物量，再充入CH4提高其氧化甲烷的活性。<

5、br>　　對AEM1235菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化分析，該菌為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，菌落呈圓形，大小0.5-1mm、半透明的灰白色、邊緣整齊。能夠利用甲醇、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉等。接觸酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)為陽性;吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)則為陰性。經(jīng)16SrDNA序列分析，對序列進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)AEM1235的16SrDNA序列與嗜甲基生絲微菌屬（AB680579.1Hypro

6、microbiummethylovorumg）關(guān)系最緊密。測定其生長情況，表明在甲烷為唯一碳源條件下AEM1235菌株生長較慢，培養(yǎng)8d后達(dá)到最大生長量，因此對于后續(xù)煤樣中甲烷氧化試驗(yàn)的培養(yǎng)物選用7-8d的培養(yǎng)物。
　　取培養(yǎng)7-8d的AEM1235培養(yǎng)物平板菌落計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為為1.0×108cfu/ml，用于煤樣中甲烷的氧化實(shí)驗(yàn)。在煤樣中加入甲烷氧化菌菌懸液，抽氣后分別充入CH4與O2的1∶1混合氣體、純CH4氣體進(jìn)行等溫

7、吸附實(shí)驗(yàn)，氣相色譜測定放出氣體體積和其中各種成分的含量。結(jié)果表明不加甲烷氧化細(xì)菌的煤樣進(jìn)行的甲烷氣體的吸附與脫吸附實(shí)驗(yàn)氣體中的甲烷量沒有變化。充入CH4與O2的1∶1混合氣體，氣體中甲烷含量和氧濃度明顯降低，表明甲烷氧化菌對甲烷具有吸收和利用的能力，即在高壓有氧條件下煤樣中的甲烷被氧化。在充氣壓強(qiáng)為5MPa、接種量12.5％條件下，CH4與O2消耗量之比為1∶1.933，同時有少量CO2的生成,表明吸收的甲烷被氧化后主要以中間氧化物形式

8、存在。
　　對吸附煤樣充入純的CH4氣體，放出氣體中甲烷含量和氧濃度同樣有明顯的降低、有CO2的生成，但甲烷和氧的消耗量均明顯低于充氧條件下的消耗量，在12.5％接種量和充氣壓強(qiáng)5.0MPa條件下，吸收的甲烷量是充氧條件下的58％，但CO2的生成量明顯高于有氧條件，表明甲烷氧化菌AEM1235在高壓缺氧條件下對甲烷仍然具有吸收和利用的能力。上述結(jié)果提示我們，甲烷氧化細(xì)菌在地下煤層的高壓和缺氧的條件下有可能具有吸收和氧化煤層中結(jié)合態(tài)