內(nèi)生細(xì)菌EBS05代謝活性物質(zhì)的分離純化及抗煙草花葉病毒活性的初步研究.pdf

1、EBS05是一株從樟樹周皮組織中分離的內(nèi)生細(xì)菌，對多種植物病原菌真菌和煙草花葉病毒具有較強(qiáng)的拮抗活性，且具有耐酸堿、耐鹽、耐高溫、抗生作用穩(wěn)定等作為生防因子的優(yōu)良特性。為了進(jìn)一步研究和挖掘EBS05的生防潛力，本文對樟樹內(nèi)生細(xì)菌EBS05的分類鑒定、代謝活性物質(zhì)分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其抗病毒活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，主要研究結(jié)果如下： 1、在形態(tài)學(xué)分類的基礎(chǔ)上，通過16S rDNA和16S～23S rDNA ISR（Itergenic

2、spacer regions）序列分析，對樟樹內(nèi)生細(xì)菌EBS05進(jìn)行了分類鑒定。結(jié)果表明，EBS05為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。 2、EBS05代謝活性物質(zhì)特性研究結(jié)果表明，活性物質(zhì)在λ213.5nm處有最大光吸收峰；在pH5～8范圍內(nèi)抗菌活性穩(wěn)定，當(dāng)pH<5或pH>10時，抗菌活性顯著降低；熱穩(wěn)定性良好，60℃～80℃處理2h后，抗菌活性不變，0.1Mpa、121℃濕熱滅菌處理30min后，抗菌活性仍然

3、保持在65％以上；具有較強(qiáng)的抗紫外線照射能力，對蛋白酶K不敏感；具有較好的醇溶性，易溶于甲醇和乙醇，不溶于乙酸乙酯、乙腈和石油醚等有機(jī)溶劑。 3、在明確代謝活性物質(zhì)特性的基礎(chǔ)上，探索了活性組分分離純化的條件和工藝。發(fā)酵液經(jīng)酸沉淀（pH2.0）后，用甲醇提取3次，蒸干后的樣品上Sephadex LH-20層析柱，用甲醇洗脫，然后以氯仿：甲醇：水（65：25：4）為洗脫液進(jìn)行硅膠柱層析，再經(jīng)制備型反相C18 HPLC分離，收集活性峰

4、，收集液經(jīng)冷凍干燥后即得活性組分純品。 4、活性組分純品經(jīng)氨基酸組分分析和串聯(lián)質(zhì)譜分析表明，EBS05所產(chǎn)生的抗TMV活性組分為4個分子量相差14D的脂肽類同系物，其分子量分別為1035.65D、1021.64D、1007.63D和993.65D。脂肽的肽鏈結(jié)構(gòu)為[Glu·Leu·Leu·Val·Asp·Leu·Leu]，分子結(jié)構(gòu)式為：CH3-（CH2）（s-11）-CH-CH2-CO-L-Glu—L-Leu—D-Leu—L-V