小麥TaSSP1基因和其擬南芥同源基因AT3G14067的克隆及其功能分析.pdf

1、類枯草桿菌蛋白酶(Subtilases)在植物體內(nèi)廣泛分布，且數(shù)目眾多，廣泛參與植物的生長發(fā)育，以及響應(yīng)外界環(huán)境變化參與代謝調(diào)控等，但目前該類蛋白酶在植物體內(nèi)的具體功能和作用機制等方面還不完全清楚。本課題組在前期研究中，從小麥暗誘導(dǎo)衰老的葉片中分離純化了一種與葉片衰老相關(guān)的類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，命名為TaSSPl(TriticumaestivumSubtilisin-likeSerineProteasel)，并通過質(zhì)譜鑒定所得數(shù)據(jù)在N

2、CBI數(shù)據(jù)庫中比對，獲得了該蛋白酶氨基酸序列的部分信息，但該蛋白酶在小麥生長發(fā)育中到底具有哪些功能不完全清楚。本研究根據(jù)已知的該蛋白酶氨基酸部分序列，采用RACE的方法得到了小麥的該蛋白酶基因TaSSP1全長序列。之后，通過將TaSSP1氨基酸序列在國際蛋白酶數(shù)據(jù)庫（MEROPS）中進行比對，發(fā)現(xiàn)了在擬南芥中與該蛋白酶相似度達77.8％的同源蛋白AT3G14067，而AT3G14067蛋白在擬南芥中的具體功能也尚不清楚。因此，本文在上述

3、研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進一步通過RT-PCR、熒光定量PCR、Westernblot、SDS-PAGE、天然梯度凝膠活性電泳和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等方法手段，主要從基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達及酶活性表現(xiàn)的水平上研究分析了TaSSP1和AT3G14067基因在小麥和擬南芥生長發(fā)育及在響應(yīng)環(huán)境變化中的具體功能，得到的主要研究結(jié)果如下:
　　1)根據(jù)已知TaSSP1的氨基酸部分序列，采用RACE的方法獲得了小麥蛋白酶基因TaSSP1全長序列，并在GenBa

4、nk進行了登錄，登記號為:JX962746。
　　TaSSP1基因CDS區(qū)全長2361bp，編碼786個氨基酸，在絲氨酸蛋白酶家族中屬于S8A家族。對TaSSP1蛋白結(jié)構(gòu)進行生物信息學(xué)分析，該蛋白酶含有五個結(jié)構(gòu)域，分別為N端信號肽、I9Inhibitor區(qū)域、PA(Protease-associated)結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和C端延長區(qū)域。
　　通過熒光定量PCR對TaSSP1基因的小麥組織特異性表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)TaSS

5、P1基因在不同衰老程度的葉片中，衰老程度更嚴(yán)重的葉片中TaSSP1的mRNA表達量更高;在葉片的不同部位中，葉尖部位的TaSSP1表達量較高;暗處理葉片衰老中，發(fā)現(xiàn)隨著暗處理時間延長，葉片衰老程度加深，葉片TaSSP1的mRNA表達水平和蛋白酶活力均逐漸升高。葉片TaSSP1基因的表達亦受植物激素ABA、6-BA和乙烯的影響，其mRNA表達和酶活力水平隨著ABA處理時間（0-48h，或0-72h）的延長逐漸不斷升高;而在6-BA處理下，

6、其mRNA表達和酶活力水平都是呈現(xiàn)先升高后降低并降低到對照(0h)時的以下水平。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，TaSSP1基因的表達還能明顯地被外界滲透脅迫所誘導(dǎo)，如小麥在200mMNaC1、蔗糖和甘露醇以及16％PEG6000的脅迫處理下，葉片中TaSSP1基因的mRNA表達量均明顯上升。Westernblot與SDS-PAGE實驗結(jié)果顯示，在ABA和16％PEG6000處理的72h過程中，隨著TaSSP1蛋白表達水平的不斷提高，葉片Rubisco大亞

7、基的含量逐漸減低，表明隨著TaSSP1蛋白酶含量的不斷升高，Rubisco大亞基的降解程度逐漸加劇。而在6-BA處理下，其蛋白表達水平也是呈現(xiàn)先升后降并降低到低于對照(0h)時以下水平，Rubisco大亞基的含量幾乎沒有發(fā)生明顯的變化。另外，實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn):Cu2+和Ca2+能顯著促進TaSSP1酶活力的提高，Zn2+和Mn2+對該酶也有一定的促進作用，但Mg2+和Co2+則對酶活力沒有促進作用。以上結(jié)果表明:TaSSP1可能是小麥生長

8、發(fā)育中的一種重要的Ca2+依賴性的類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶不僅密切與小麥的衰老進程相關(guān)，而且能通過上調(diào)基因表達及加快蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)去積極應(yīng)對如滲透脅迫等的環(huán)境脅迫。
　　2)對AT3G14067蛋白酶進行生物信息學(xué)的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)AT3G14067蛋白酶與TaSSP1蛋白酶的結(jié)構(gòu)非常相似，同樣屬于S8A蛋白家族，亦含有N端信號肽、I9Inhibitor區(qū)域、PA結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和C端延長區(qū)域等五個結(jié)構(gòu)域。
　　通過半定

9、量RT-PCR對AT3G14067基因在擬南芥的組織特異性表達進行分析，結(jié)果顯示:AT3G14067基因在莖、蓮座葉和莖生葉中的mRNA表達量最高，這與在植物膜蛋白數(shù)據(jù)庫中比對分析的結(jié)果相吻合。研究結(jié)果還顯示，AT3G14067基因能明顯受植物激素ABA、6-BA、乙烯和水楊酸的誘導(dǎo)而上調(diào)表達，生長素類似物NAA和赤霉素可輕微提高AT3G14067基因的表達水平，但在茉莉酸甲酯處理下，AT3G14067的轉(zhuǎn)錄表達水平?jīng)]變化。此外，AT3

10、G14067同樣能明顯受NaC1、甘露醇、PEG6000和蔗糖等滲透脅迫的誘導(dǎo)而上調(diào)表達。
　　暗誘導(dǎo)處理擬南芥蓮座葉葉片后，發(fā)現(xiàn)處理12h后AT3G14067基因的轉(zhuǎn)錄表達水平開始上調(diào)，48h時的表達量達到最高;在不同衰老程度的蓮座葉葉片中，發(fā)現(xiàn)衰老程度嚴(yán)重的葉片中AT3G14067基因的轉(zhuǎn)錄表達水平更高，表明AT3G14067基因也與葉片的衰老相關(guān)。
　　在野生型擬南芥種子的萌發(fā)實驗中，發(fā)現(xiàn)在黑暗、藍光、遠紅光的培養(yǎng)條件

11、下，AT3G14067基因的mRNA表達量會顯著上升，其中以黑暗和遠紅光處理的最為明顯。這表明AT3G14067基因?qū)Σ煌赓|(zhì)也有響應(yīng)。
　　上述結(jié)果初步表明，AT3G14067蛋白酶也不僅與擬南芥的衰老有關(guān)，而且可能與擬南芥的生長發(fā)育密切相關(guān)。
　　3)通過轉(zhuǎn)基因獲得了AT3G14067基因過表達擬南芥株系OX-3、OX-4和OX-6，經(jīng)熒光定量PCR鑒定突變體ssp-1為純合體。對擬南芥的野生型、突變體和過表達株系的表型

12、進行比較發(fā)現(xiàn)，在黑暗萌發(fā)條件下，AT3G14067基因過表達株系下胚軸顯著伸長，突變體株系輕微伸長，突變體與野生型的差異不明顯;過表達株系抽苔時間與野生型的相比要提前5天左右，但過表達植株和突變體植株的種子均會提前成熟;在自然生長條件下，過表達植株還表現(xiàn)出主莖頂端生長點丟失，株高變矮，而突變體則株高變高，表型相反;過表達株系植株的分枝數(shù)、果莢數(shù)顯著高于突變體和野生型植株，但過表達株系果莢長度變短、單果莢種子數(shù)變少、單果莢重量減輕、單株種

13、子總數(shù)提高，而突變體則表現(xiàn)為果莢變長、單果莢種子數(shù)、重量均提高;同一時期蓮座葉葉片過表達植株葉片的衰老程度與野生型和突變體相比為更嚴(yán)重。
　　對上述擬南芥不同株系進行生理生化分析，結(jié)果表明:當(dāng)植株生長至50d時，突變體中的蓮座葉葉片的葉綠素含量要顯著高于野生型和過表達株系;在植株生長至60d、70d時，過表達株系中蓮座葉片中的可溶性蛋白含量要顯著高于野生型，而突變體與野生型的相比差異不明顯;在40d以后，過表達株系中TBARS含量

14、逐漸升高，在60d時株系中的TBARS含量顯著高于野生型和突變體植株的含量;在植株生長至50d時，過表達株系中的POD、SOD、CAT酶活力都會明顯下降，而脯氨酸含量在40d以后不斷升高，與野生型和突變體植株的相比，差異極為顯著。
　　選取擬南芥中與葉片衰老相關(guān)的基因，采用熒光定量RT-PCR方法對擬南芥不同株系進一步分析了他們的表達情況，發(fā)現(xiàn)SAG12基因的轉(zhuǎn)錄水平在過表達株系中明顯上調(diào)，而在突變體中明顯下調(diào);SAG113基因的

15、表達在突變體中輕微下調(diào)，在過表達中輕微上調(diào);NAP、NAC2基因的轉(zhuǎn)錄水平在過表達株系中上升了2倍左右，而突變體與野生型的相比差異不明顯。另外，ATMYB2基因在突變體中的表達有所上調(diào)，但在過表達株系中其表達水平比野生型的高出了近5倍;WRKY6和WRKY53兩個基因在突變體中的轉(zhuǎn)錄表達也輕微上調(diào)，但這二者的轉(zhuǎn)錄水平在過表達株系中都上調(diào)2倍左右。只有SAG29基因的表達在突變體和過表達株系中都呈上調(diào)的趨勢。以上結(jié)果進一步表明:AT3G1

16、4067基因不僅直接與擬南芥的衰老相關(guān)，而且還可能通過調(diào)控其他衰老相關(guān)基因的表達促進擬南芥的衰老。
　　選取擬南芥中與下胚軸發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因，同樣采用熒光定量RT-PCR方法，對擬南芥不同株系進行其轉(zhuǎn)錄表達量分析，發(fā)現(xiàn)ABCB19、SOB7和DFL1基因的表達水平在突變體中均顯著上升，而三者在野生型和過表達株系中的表達水平差異均不顯著;FHY3基因在突變體中有輕微上調(diào)趨勢，而在野生型和過表達株系中的差異也不明顯;而RLP21基因的

17、表達水平在野生型和突變體中的差異不顯著，在過表達株系中卻呈現(xiàn)上調(diào)趨勢;DWARF6基因的表達在突變體中上調(diào)顯著，但在過表達株系中卻呈明顯下調(diào)趨勢;FEI1、AFL23、CULl、RPT1、NPL1、HY3、LCL5、MAX2基因的表達在突變體和過表達株系中均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，但在突變體中的上調(diào)程度都更高。
　　選取與擬南芥花發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因的熒光定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，AP2、ATlG01460基因在突變體中的表達水平有上調(diào)趨勢