擬南芥ros1突變抑制因子的篩選、基因克隆及其功能分析.pdf

1、外源基因插入到植物基因組中會引起本身或相關的內源基因發(fā)生轉錄水平的基因沉默。這種轉錄水平的基因沉默的過程通常是由外源基因產生siRNA，再由這些siRNA介導DNA甲基化及組蛋白修飾變化等來實現。擬南芥中現已發(fā)現，很多RNAi過程中的組件、DNA甲基轉移酶以及組蛋白甲基轉移酶等參與到這一過程中。擬南芥中編碼DNA糖基化酶的ROS1基因突變后能夠使多拷貝的轉基因ProRD29A：LUC和內源RD29A基因的啟動子區(qū)發(fā)生超甲基化，從而使內源

2、RD29A基因及外源LUC轉基因表現出轉錄水平的基因沉默現象，而與其相鄰的轉基因Pro35S：NPTⅡ的啟動子區(qū)的甲基化雖沒有發(fā)生變化但卻同樣表現出轉錄水平的基因沉默。ROS1基因作為一種DNA去甲基化酶參與抑制轉錄基因沉默過程中。 利用ros1突變體中沉默的Pro35S：NPTII轉基因作為篩選標記，我們從EMS誘變的ros1后代中篩選到了一系列ros1突變的抑制因子，其中ror1(suppressorofros1)突變體包括

3、兩個等位突變，ror1-1和ror1-2。ROR1基因的突變能夠使ros1突變背景中處于沉默狀態(tài)的Pro35S：NPTⅡ 基因恢復表達，但是對ProRD29A：LUC基因的沉默狀態(tài)卻沒有影響?；蚪M亞硫酸氫鹽測序及擬南芥基因組SouthernBlot分析結果顯示突變體中RD29A啟動子區(qū)整體甲基化情況不受ror1突變的影響，并且基因組中rDNA區(qū)和著絲粒區(qū)的DNA甲基化也不受ror1突變的影響。另外，NorthernBlot分析發(fā)現ro

4、r1ros1突變體中內源轉座子TSI的表達量卻比ros1突變體和C24野生型(ros1突變體的背景)都高。 通過對轉基因Pro35S:NPTⅡ 的啟動子區(qū)的甲基化及組蛋白修飾的分析顯示，雖然C24野生型，ros1突變體及ros1ror1雙突變體中轉基因Pro35S：NPTⅡ 的35S啟動子區(qū)甲基化情況沒有變化，但是相對于ros1突變體，ror1ros1突變體中該區(qū)域組蛋白H3-K9的二甲基化程度降低了，而組蛋白H3的乙?；潭葎t

5、升高了。這說明ror1突變引起的轉基因Pro35S：NPTⅡ嘔域基因沉默的釋放與DNA甲基化變化無關而與組蛋白的修飾狀態(tài)的變化有關。另外，ror1ros1突變體表現出明顯的發(fā)育上的異常表型，如植株矮小、早花等，一些突變體在發(fā)育晚期還出現末端花結構異常的表型。基因定位的結果顯示ROR1基因編碼一個擬南芥DNA復制蛋白A2(RPA2A，At2g24490)。ROR1/RPA2A基因在根尖及莖尖的分生組織表達量較高。ROR1/RPA2A基因突

6、變會影響根尖及莖尖頂端分生組織細胞的分裂，但是對細胞最終的大小沒有影響。亞細胞定位結果顯示，ROR1/RPA2A蛋白定位于細胞核內，該基因突變后突變體植株對DNA烷化劑甲基甲磺酸(MMS)超敏感，說明ROR1/RPA2A基因在DNA修復過程中起重要作用。由于ROS1蛋白也具有DNA修復的活性，并且酵母雙雜交體外實驗證明了ROR1/RPA2A蛋白與ROS1蛋白的互作關系，我們推測ROR1/RPA2A蛋白的DNA修復功能很可能與ROS1蛋白