小麥鹽脅迫響應(yīng)基因TaACO1和TaSTPK的克隆與功能分析.pdf

1、鹽害是影響農(nóng)作物正常生長發(fā)育及產(chǎn)量形成的主要逆境因子之一，隨著生態(tài)環(huán)境的日益惡化，土壤鹽漬化面積不斷增加，對作物的生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，開展小麥耐鹽機(jī)制的研究、耐鹽基因的分離和耐鹽新品種的選育，對于擴(kuò)大小麥種植面積、提高單位面積產(chǎn)量、保障糧食安全具有重要意義。
　　 本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作積累的基礎(chǔ)上，從山融3號和濟(jì)南177鹽脅迫后根部抑制性差減cDNA文庫基因表達(dá)譜芯片中，通過對差異基因的功能預(yù)測

2、，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的耐鹽候選基因。本實(shí)驗(yàn)選取在氯化鈉處理后表達(dá)有大幅度下調(diào)的TaACO1及TaSTPK基因?yàn)檠芯繉ο?，對其進(jìn)行了克隆、亞細(xì)胞定位、表達(dá)模式分析、異源表達(dá)和基因功能的驗(yàn)證，并對兩個(gè)基因轉(zhuǎn)化擬南芥獲得的純合株系的生理性狀進(jìn)行了鑒定，明確了目的基因的生理功能及其參與鹽脅迫的逆境響應(yīng)機(jī)理。取得的主要結(jié)果如下：
　　 1、TaACO1的克隆與功能分析成功克隆了山融3號鹽脅迫響應(yīng)基因TaACO1的ORF序列和基因組全長序列，該

3、基因的ORF序列由942個(gè)堿基對組成，基因組序列由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。
　　 從山融3號和濟(jì)南177中克隆到的該基因序列是一致的，表明山融3號的ACO1基因來源于濟(jì)南177。該基因的氨基酸序列與水稻中的一個(gè)ACC 氧化酶基因的序列同源性高達(dá)80％以上，同玉米中的兩個(gè)ACC 氧化酶基因的同源性也達(dá)到了60％以上，而與擬南芥、西紅柿中的ACC 氧化酶基因的同源性相對較低，約為40％左右。利用200 mM NaCl、100 m

4、M H2O2 處理山融3號和濟(jì)南177 時(shí)，RT-PCR的結(jié)果表明該基因呈下調(diào)表達(dá)，這與cDNA芯片的數(shù)據(jù)一致，說明該基因可能參與了逆境脅迫響應(yīng)；利用100 μM ACC處理時(shí)該基因則表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，可能原因在于ACC是ACC 氧化酶的底物，過量的底物誘導(dǎo)了ACC 氧化酶的表達(dá)。利用亞細(xì)胞定位載體TaACO1-GFP 對該基因在小麥原生質(zhì)體中進(jìn)行定位發(fā)現(xiàn)，該基因在細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)。利用pET-30a 原核表達(dá)載體將該基因在大腸桿菌BL21(

5、DE3）菌株中異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白在上清與沉淀中均有表達(dá)，上清過鎳柱純化，純化的重組蛋白與ACC 氧化酶活性測定液反應(yīng)后產(chǎn)生的氣體，使用氣相色譜儀檢測后發(fā)現(xiàn)，它們與標(biāo)準(zhǔn)乙烯氣體有相同的峰值。推斷TaACO1基因的蛋白產(chǎn)物確實(shí)有ACC 氧化酶功能，該基因應(yīng)該是小麥中的一個(gè)ACC 氧化酶基因，可以催化ACC 產(chǎn)生乙烯。植物體內(nèi)的乙烯含量的升高，可以促進(jìn)下胚軸的伸長，利用pSTART構(gòu)建過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選、鑒定并獲得純合株系，其種

6、子在1/2 MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)后在弱光照條件下生長10天左右，其下胚軸的長度明顯長于空載體和野生型植株對照，證明TaACO1的過量表達(dá)產(chǎn)生更多的乙烯促進(jìn)了下胚軸的伸長。
　　 2、TaSTPK的克隆與功能分析在山融3號和濟(jì)南177中克隆到了一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因，該基因ORF由1485個(gè)堿基對組成，山融3號與濟(jì)南177中的序列有5個(gè)堿基對及4個(gè)氨基酸的差異，該基因的基因組序列由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。利用200 mM

7、 NaCl、100 mMH2O2 處理山融3號和濟(jì)南177后，RT-PCR的結(jié)果表明該基因均呈下調(diào)表達(dá)，說明該基因參與了植物逆境脅迫響應(yīng)過程。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，TaSTPK基因在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)。該基因的純合過表達(dá)擬南芥株系的種子在鹽處理?xiàng)l件下萌發(fā)早于空載體對照，且100 mM NaCl 處理?xiàng)l件下萌發(fā)率明顯高于后者，表明該基因在鹽脅迫條件下種子萌發(fā)的過程中起作用。在大腸桿菌BL21(DE3）菌株中異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要在包

8、涵體中表達(dá)，由于包涵體的復(fù)性非常復(fù)雜且復(fù)性的效率較低，重組蛋白的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性未檢測到。
　　 通過對兩個(gè)基因的分析，明確了其序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、脅迫條件下表達(dá)模式的變化，對其功能進(jìn)行了初步的探討，證明兩個(gè)基因在鹽脅迫響應(yīng)的信號通路中起作用，為小麥的耐鹽機(jī)制的研究提供了參考依據(jù)。
　　 3.蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜鈣離子通道的電生理記錄、鑒定及分析本部分實(shí)驗(yàn)以Ca 2+為通透離子，對蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜電壓依賴的Ca 2+通道

9、進(jìn)行了記錄及分析，以Gd 3+作為抑制劑的研究結(jié)果顯示記錄的電流信號是Ca 2+通透形成的。
　　 但電流的逆轉(zhuǎn)電位分析則顯示與理論的Ca 2+平衡電位差距很大，進(jìn)一步的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)的K +濃度是影響電流逆轉(zhuǎn)電位的重要的因素，表明該類電壓依賴的Ca 2+通道可以介導(dǎo)K +的外流，同時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜上還存在有同樣通透特性的大電導(dǎo)的電壓依賴的Ca 2+通道，推測可能與保衛(wèi)細(xì)胞區(qū)域性的鈣離子濃度升高并在氣孔的快速關(guān)閉中起作用。該研究結(jié)