牛消化道Ⅰ型肽載體(bPepTI)表達定量與真核表達技術研究.pdf

1、mRNA及蛋白質表達定量技術和真核表達技術是研究牛小肽吸收營養(yǎng)生理意義及bPepTI轉運特性的必要技術手段。本研究采用Real TimePCR相對和絕對定量方法測定了牛消化道各段bPepTI基因mRNA的表達量；構建了bPepTI蛋白的原核表達系統(tǒng)表達bPepTI蛋白，為建立牛消化道bPepTI蛋白表達的免疫熒光定量技術奠定了基礎；構建了bPepTI基因的真核表達載體，為構建bPepTI真核表達系統(tǒng)提供了前端關鍵技術。 1、牛消

2、化道各段I型肽載體(bPepTI)mRNA表達的定量研究 試驗采用RT-PCR相對定量方法檢測利木贊×魯西黃牛雜交牛消化道各部位及渤海黑牛、荷斯坦牛、魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛四個不同品種牛小腸.PepTImRNA的表達差異。結果表明，牛各段消化道bPepTImRNA表達量由高到低的順序依次為空腸、回腸、盲腸、十二指腸、瘤胃、結腸、皺胃、瓣胃、網(wǎng)胃，消化道各段表達差異不顯著(P>0.05)，消化道各段表達差異不顯著(P>0

3、.05)；不同品種牛小腸PepTImRNA的表達：十二指腸組織，四個品種之間差異極顯著(P<0.01)，荷斯坦牛表達量最高，顯著高于渤海黑牛(P<0.05)，極顯著高于魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛(P<0.01)，魯西黃牛與渤海黑牛、利木贊×魯西黃牛雜交牛差異不顯著(P>0.05)，渤海黑牛顯著高于利木贊×魯西黃牛雜交牛(P<0.05)；空腸組織，品種之間差異極顯著(P<0.01)，魯西黃牛表達量最高，與渤海黑牛、荷斯坦牛和利木贊×

4、魯西黃牛雜交牛差異顯著(P<0.05)，渤海黑牛和利木贊×魯西黃牛差異不顯著(P>0.05)，與荷斯坦牛差異顯著(P<0.05)；回腸組織，品種之間表量差異極顯著(P<0.01)，荷爾斯坦牛表達量最高，顯著高于渤海黑牛、魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛(P<0.05)，魯西黃牛和利木贊×魯西黃牛雜交牛差異不顯著(P>0.05)。 絕對定量法檢測利木贊×魯西黃牛雜交牛消化道各部位PepTImRNA表達量。結果顯示，表達量由高到低依

5、次為：空腸、瓣胃、網(wǎng)胃、瘤胃、盲腸、十二指腸、回腸、皺胃、結腸，總體差異極顯著((P<0.01)。在胃部組織中，瓣胃bPepTI表達量最高，與網(wǎng)胃差異不顯著(P>0.05)，但極顯著高于瘤胃和皺胃(P<0.01)；網(wǎng)胃bPepTI的表達量與瘤胃和皺胃差異顯著(P<0.05)，瘤胃和皺胃之間差異不顯著(P>0.05)。腸道組織中，空腸bPepTI的表達量最高，極顯著高于十二指腸、回腸(P<0.01)；十二指腸與盲腸、回腸不差異顯著(P>0

6、.05)，十二指腸、回腸、盲腸顯極著高于結腸(P<0.01)?？漳cbPepTI的表達量顯著高于瓣胃(P<0.05)；瘤胃、十二指腸、回腸與盲腸之間差異不顯著(P>0.05)，十二指腸、回腸、盲腸與皺胃之間表達量差異不顯著(P>0.05)。結合本試驗及其它試驗研究結果，bPepTImRNA的表達量，空腸最高，其次是瓣胃，大腸表達量最低。 2、牛消化道I型肽載體(bPepTI)原核表達 為通過原核表達獲得純化bPepTI蛋白

7、，進而能夠制備bPepTI蛋白抗體，建立消化道bPepTI蛋白表達量的熒光免疫定量方法，本試驗通過優(yōu)化PCR擴增條件克隆了bPepTI基因的完整編碼區(qū)，分別與pET-32α和pGEX-6P-J載體連接，構建了原核表達載體并分析了bPepTI蛋白結構。通過優(yōu)化IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間、感受態(tài)細胞等條件進行蛋白表達，在所優(yōu)化的表達條件下，重組體在大腸桿菌表達系統(tǒng)中未表達到理想蛋白，經(jīng)分析bPepTI含有8個糖基化位點，5個PKC和1