豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異及GM-CSF對GP3-GP5的免疫增強作用研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩161頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于動脈炎病毒科,基因組為單股正鏈RNA,具有快速變異特性。自1991年首次分離獲得病毒以來,該病毒基因逐漸發(fā)生變化并伴隨著給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失。2000年美國出現(xiàn)非典型PRRSV,免疫商品豬群和母豬群出現(xiàn)嚴重死亡。PRRS于1996年在我國首次爆發(fā),并逐漸傳播各省市。2006年在中國大陸地區(qū)多

2、省份出現(xiàn)高致病性PRRS,主要臨床表現(xiàn)為持續(xù)高熱(41.0℃以上)、皮膚發(fā)紅,發(fā)病率和死亡率高。病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2上存在30個氨基酸缺失。近年來,PRRSV持續(xù)流行,造成了我國養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。為了深入闡明該病毒基因遺傳變異規(guī)律和NSP2毒力作用,探索該病毒新的免疫防控方法,本研究從華東地區(qū)部分省份2004-2009年發(fā)病豬群分離獲得38株PRRSV,并對其NSP2基因高變異區(qū)進行了克隆和序列分析;根據(jù)基因分析結(jié)果,從中選擇4株

3、PRRSV流行毒株進行仔豬人工感染發(fā)病試驗,研究NSP2基因變異與病毒毒力間的關系;同時,設計構(gòu)建共表達PRRSV GP3和GP5與豬粒細胞巨噬細胞集落細胞刺激因子(Granulocyte/macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)融合蛋白重組腺病毒,并進行了小鼠和豬體免疫試驗,具體研究內(nèi)容和結(jié)果分為以下5個部分:
   1.我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株分離與鑒定
  

4、 2004-2009年在臨床流行病學研究基礎上,從江蘇、上海、山東、安徽、浙江和廣西等省市收集臨床發(fā)病豬場仔豬肺臟病料,經(jīng)勻漿、凍融和過濾處理后接種Macr-145或豬肺泡巨噬細胞(PAM),通過CPE觀察、RT-PCR檢測和PRRS陽性抗體間接免疫熒光試驗鑒定,分離獲得38株PRRSV,其中,32株病毒直接采用Macr-145細胞分離獲得,其余6株病毒則是先用PAM細胞分離,然后接種Marc-145細胞分離獲得;分離病毒在Marc-1

5、45細胞上培養(yǎng)特性有一定差異,病毒毒價為103.75-106.33 TCID50/ml,為PRRSV研究提供了重要物質(zhì)基礎。
   2.2004-2009年豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異分析
   根據(jù)PRRSV NSP2基因設計合成2對PCR引物,采用巢式RT-PCR方法對上述分離的38株PRRSV NSP2基因高變區(qū)進行克隆和測序分析,結(jié)果顯示:不同毒株PCR擴增產(chǎn)物長度有所不同,共出現(xiàn)5種長度類

6、型,分別為:1215、1275、1287、1373和1374bp。38株PRRSV核苷酸同源性為71.6%-99.6%,推測的氨基脧同源性為63.7%-98.3%。NSP2基因進化分析結(jié)果顯示,38株分離株可以分為兩個基因亞型,即NSP2基因亞型Ⅰ和NSP2基因亞型Ⅱ,其中,NSP2基因亞型Ⅰ內(nèi)的毒株有28株,具有30個或更多個氨基酸的缺失,基因同源性為92.9%-99.2%;NSP2基因亞型Ⅱ內(nèi)的毒株具有1個或不具有氨基酸的缺失,但基

7、因差異較大,基因同源性為76.5%-99.6%。根據(jù)NSP2基因高變區(qū)基因缺失情況,38株PRRSV分離株分為5種類型,其中,30aa缺失型毒株比例最高(26/38),2種新的NSP2基因缺失類型的PRRSV毒株出現(xiàn)于2008年后。該研究結(jié)果表明,我國PRRSV流行毒株NsP2基因變異較大,并不斷出現(xiàn)新的變異毒株,加強PRRSV流行毒株基因變異監(jiān)測十分必要。
   3.豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2基因變異與毒力變化間的關系研究

8、
   根據(jù)上述PRRSV NSP2基因序列分析結(jié)果,選擇4個PRRSV毒株,包括YX0907、BB0907、SY0909和NT0801毒株,其中,YX0907、BB0907和SY0909毒株屬于基因亞型Ⅰ,具有30個氨基酸缺失的特征,NT0801屬于NSP2基因亞型Ⅱ,其NSP2上不存在缺失。GP5基因序列分析結(jié)果為:4株PRRSV毒株GP5基因同源性為98.0%-99.8%,其氨基酸同源性為97.5%-99.5%。選擇23頭

9、45日齡PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和副豬嗜血桿菌(HPs)陰性健康商品仔豬,隨機分為5組,第1-4組分別頸部肌肉注射上述4株PRRSV分離株(第3代),2×104.32TCID50/1ml/頭,第5組3頭豬作為空白對照,隔離飼養(yǎng)21d,每天測量體溫,觀察臨床癥狀;攻毒后第7d、14d和21d采血分離血清,測定PRRSV含量;對死亡豬和第21天處死豬進行病理解剖,觀察肉眼病理變化和組織病理變化,并進行記分和比較,結(jié)果顯示,BB

10、0907毒株毒力最強,試驗豬感染后體溫明顯升高,臨床癥狀明顯,可引起3/5死亡,病豬肺臟組織具有明顯病理變化;YX0907毒株毒力較強,試驗豬臨床癥狀和病理變化明顯,可引起2/5死亡;NT0801毒力較弱,部分豬感染后出現(xiàn)1-2d體溫升高和輕度臨床癥狀,但未引起死亡;SY0909毒株毒力最弱,感染豬出現(xiàn)1-3d體溫升高,臨床癥狀不明顯,病理變化較輕;而對照組豬無臨床異常表現(xiàn)和病理變化。該研究結(jié)果表明,PRRSV分離株毒力存在明顯差異,4

11、個毒株毒力高低為:BB0907>YX0907>NT0801>SY0909。具有NSP2相同基因缺失類型的3個PRRSV分離株毒力差異較大,證實PRRSV毒力與NSP2的30個氨基酸基因缺失沒有直接聯(lián)系。
   4.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP3-GP5與豬GM-CSF融合基因重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
   利用PCR擴增出高致病性PRRSV SY0608分離株的GP3和GP5基因及豬粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)

12、基因,并按順序?qū)⑺鼈冞B入梭載體pShuttle-CMV,并在GM-CSF和GP3之間及GP3和GP5間分別插入FMDV2A基因和“AAGCTT”連接子,重組穿梭載體經(jīng)酶切和測序鑒定后用PmeⅠ線性化,然后電轉(zhuǎn)化入基因工程菌株大腸桿菌BJ5183內(nèi),與腺病毒骨架載體pAdEasy-1重組,獲得重組腺病毒質(zhì)粒。將重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化,然后用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞,10d后獲得重組腺病毒,命名為rAd-GF35。用RT

13、-PCR方法檢測,可以擴增獲得長度約1.8kb的GM-CSF-GP3-GP5融合表達轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;用豬抗PRRSV陽性血清和小鼠免疫原核表達豬GM—CSF蛋白獲得的血清進行間接免疫熒光試驗(IFA),證明該重組腺病毒在293A細胞中可以表達GM-CSF和GP3-GP5目的蛋白;用Western blot檢測,結(jié)果顯示GM-CSF-GP3-GP5融合蛋白能夠正確表達,且抗原性良好;豬骨髓細胞用感染rAd-GF35的PK-15細胞上清刺激,可以

14、表現(xiàn)明顯增殖并形成集落。該研究結(jié)果證明,本研究構(gòu)建的重組腺病毒rAd-GF35可以有效表達GM-CSF-GP3-GP5重組蛋白,并具有GM-CSF生物活性。
   5.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP3-GP5與豬GM-CSF融合基因重組腺病毒小鼠免疫特性研究
   取60只BALB/c小鼠,隨機分為4組,每組15只。第1和第2組分別背部皮下注射PBS緩沖液和野生型腺病毒(wtAd)作為對照組,第3和第4組分別于背部皮下注射重

15、組腺病毒rAd-GP35(表達GP3-GP5融合蛋白)和rAd-GF35(表達GM-CSF-GP3-GP5融合蛋白),接種劑量為1010TCID50/0.5ml/只,隔離飼養(yǎng)3周后用同樣方法加強免疫一次。首次免疫后不同時間,隨機抽取5只/組采血和取脾臟,分別檢測PRRSV特異抗體、淋巴細胞增殖指數(shù)、IFN-γ和IL-4,結(jié)果為:第3-4組小鼠在免疫后21d,均可以檢測到PRRSV特異ELISA抗體產(chǎn)生,42d達到最高,抗體水平差異顯著(

16、P<0.05);首次免疫后42d,rAd-GF35免疫組抗體最高可達1:128,平均效價為1:80,顯著高于rAd-GP35免疫組(1:32)(P<0.05):同時,rAd-GF35免疫組小鼠淋巴細胞增殖指數(shù)(Stimulation Index,SI)平均值顯著高于rad-GP35免疫組(P<0.05);rAd-GF35免疫組小鼠脾細胞經(jīng)PRRSV抗原體外刺激后,細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ平均含量為175pg/ml,IL-4平均含量為87

17、.3 pg/ml,而rAd—GP35免疫小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的含量只有117.3 pg/ml和46.5pg/ml,差異顯著(P<0.05)。該結(jié)果表明,重組腺病毒rAd-GF35誘導的體液免疫和細胞免疫明顯高于重組腺病毒rAd-GP35,GM-CSF可以顯著增強GP3/GP5蛋白在小鼠體內(nèi)的免疫反應。
   6.豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP3-GP5與豬GM-CSF融合基因重組腺病毒仔豬免疫保護效力研究

18、   取15頭2周齡的PRRSV、PCV2和HPs陰性健康商品仔豬,隨機分為3組,每組5頭,隔離飼養(yǎng)。第1和第2組肌肉注射重組腺病毒rAd-GF35和rAd-GP35,第3組同樣方法接種野生型腺病毒(wtAd)作為對照,接種劑量為5×1010.0TCID50/1ml/頭,間隔3周后用同樣方法加強免疫一次,免疫后不同時間采血,測定ELISA抗體和豬外周血淋巴細胞(PBMC)增殖指數(shù)SI;首免后42d用PRRSV-SY0608強毒滴鼻,2

19、×104.0 TCID50/1ml/頭,每個鼻孔1 ml,攻毒后分別觀察臨床癥狀、PRRSV病毒血癥和病理變化,并進行綜合記分和比較,結(jié)果為:免疫后21d,重組腺病毒rAd—GP35和rAd-GF35組ELISA抗體水平顯著高于wtAd,rAd—GF35組中和抗體水平最高可達1:10,平均效價1:7.6,而rAd-GP35免疫組最高為1:8,平均效價<1:5;免疫后42d,rAd-GF35免疫組PBMC增殖指數(shù)SI平均值顯著高于rad—

20、GP35免疫組(P<0.05);rAd-GF35免疫組豬血清中IFN-γ與IL-4含量為276.2 pg/ml和312.7 pg/ml,顯著高于rAd-GP35免疫豬血中的94.6 pg/ml和242.5pg/ml(P<0.05)。攻毒后,rAd-GF35免疫組臨床癥狀明顯減輕,綜合評定數(shù)值為26.2,顯著低于rAd-GF35免疫組的44和wtAd組的82.2(P<0.05);攻毒后7d,rAd-GF35、rAd-GP35和wtAd組豬

21、血清病毒含量分別為1.5×103.0、3.3×103.0和1.0×104.0個TCID50,三個組間差異顯著(P<0.05)。此外,對照組豬攻毒后出現(xiàn)明顯病理變化,包括肺臟出血、炎性浸潤和肺泡損傷等,其次為rAd-GP35,而rAd-GF35無明顯病理變化。該研究結(jié)果證明,rAd-GF35免疫可以提供仔豬較好免疫保護作用。
   綜上所述,我國流行PRRSV毒株發(fā)生了新的變異,多種NSP2基因缺失類型病毒株同時存在,豐富了PRR

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論