楊扇舟蛾等幾種重要林業(yè)昆蟲(chóng)細(xì)胞系的建立及顆粒體病毒體外增殖研究.pdf

1、迄今為止，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了來(lái)源于150多種昆蟲(chóng)的800株以上的昆蟲(chóng)細(xì)胞系，其中260株以上為鱗翅目昆蟲(chóng)的細(xì)胞系，但相對(duì)于已知的幾十萬(wàn)種昆蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，這些細(xì)胞系還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在某些研究方面，仍然需要特定昆蟲(chóng)種類(lèi)來(lái)源或者特定細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞系。在培養(yǎng)細(xì)胞中，各種病毒也具有不同的受納細(xì)胞系統(tǒng)。一般說(shuō)來(lái)，核型多角體病毒比較容易在昆蟲(chóng)細(xì)胞系中復(fù)制，但在顆粒體病毒中至今尚未建立一個(gè)比較滿(mǎn)意的顆粒體病毒—細(xì)胞離體系統(tǒng)，因此，有必要建立更多新的昆蟲(chóng)細(xì)胞系，為害

2、蟲(chóng)病毒的規(guī)?；瘮U(kuò)增打下基礎(chǔ)。本研究選取9種重要的林業(yè)害蟲(chóng)進(jìn)行細(xì)胞系建立和桿狀病毒增殖，并嘗試對(duì)已建立的細(xì)胞系進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)，試圖為林業(yè)昆蟲(chóng)病毒殺蟲(chóng)劑的規(guī)?；a(chǎn)以及桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建和研究，提供有效的技術(shù)手段。
　　本研究選取的9種重要的林業(yè)害蟲(chóng)為：楊扇舟蛾（Clostera anachoreta）、美國(guó)白蛾（Hyphantria cunea）、春尺蠖（Apocheima cinerarius）、棗尺蠖（Sucra juj

3、uba）、茶尺蠖（Ecotropis Obliqua）、光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）、桑天牛（Apriona germari）、鞭角華扁葉蜂（Chinolyda flagellicornis）、月季葉蜂（Arge pagana）。對(duì)這些害蟲(chóng)先進(jìn)行解剖，取胚胎、卵巢、精巢、血細(xì)胞和脂肪體，然后建立原代培養(yǎng)，選用TNM-FH, IPL－41, Excell－405, Excell－420, TC-100昆蟲(chóng)

4、培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，產(chǎn)下約4天的鱗翅目昆蟲(chóng)受精卵比較容易游離出細(xì)胞并建立成細(xì)胞系。
　　經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，成功建立了兩株來(lái)源于楊扇舟蛾胚胎的細(xì)胞系，分別命名為CAF-ClanⅠ和CAF-ClanⅡ，現(xiàn)已傳代分別傳到第78代和57代，其合適的培養(yǎng)液為T(mén)NM-FH＋10％滅活的胎牛血清，最適宜的pH值是6.4。兩株細(xì)胞系的特點(diǎn)為：CAF-ClanⅠ細(xì)胞大部分懸浮，有少量貼壁，細(xì)胞的形狀有：圓形、梭形和似巨噬形3種；CAF-ClanⅡ的細(xì)

5、胞大部分貼壁，主要由圓形和梭形細(xì)胞組成。在27℃培養(yǎng)條件下，CAF-Clan I第22代細(xì)胞和CAF-Clan II第24細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為68.5h和38.2h；兩株細(xì)胞系第15代的染色體數(shù)目范圍大部分在62～100之間，也有少數(shù)細(xì)胞超過(guò)260(n=30)。隨后，運(yùn)用DAF-PCR方法鑒定了這兩種細(xì)胞系表明其來(lái)源于楊扇舟蛾。并測(cè)定了兩株細(xì)胞系對(duì)幾種桿狀病毒的敏感性。結(jié)果顯示：CAF-ClanⅡ細(xì)胞系對(duì)楊扇舟蛾顆粒體病毒（Clan

6、GV）、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）、茶尺蠖核型多角體病毒（EoNPV）三種病毒敏感，所產(chǎn)生AcMNPV和EoNPV的包涵體產(chǎn)量分別為129±4OBs/細(xì)胞和124±15 OBs/細(xì)胞。出芽型ClanGV（ClanBV）接種CAF-Clan II的TCID50為6.5×105 TCID50/mL。與CAF-ClanⅡ相比，CAF-ClanⅠ細(xì)胞系對(duì)ClanGV和AcMNPV敏感性稍低，對(duì)EoNPV、美國(guó)白蛾核型多角體病毒（

7、HcNPV）和春尺蠖核型多角體病毒(AciNPV)不敏感。兩株細(xì)胞系長(zhǎng)期凍存在－80℃和液氮中并多次成功復(fù)蘇。CAF-Clan I的單細(xì)胞克隆正在進(jìn)行放大培養(yǎng)。
　　研究中，還進(jìn)行了所培養(yǎng)的細(xì)胞系接種、復(fù)制楊扇舟蛾顆粒體病毒的試驗(yàn)。結(jié)果表明，兩種細(xì)胞系接種楊扇舟蛾顆粒體病毒后，在15℃和27℃的溫度條件下，受侵染的細(xì)胞系細(xì)胞切片在電子顯微鏡下觀察，可見(jiàn)病毒發(fā)生基質(zhì)、核衣殼、病毒粒子和包涵體等不同階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生，但未觀察到包涵體

8、中的單粒包埋病毒粒子，包涵體大小與接種的楊扇舟蛾顆粒體病毒大小一致，表明ClanGV可以侵染CAF-ClanI和CAF-ClanII細(xì)胞，但復(fù)制是否完整需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。
　　針對(duì)兩株細(xì)胞系在幾種培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)狀況，嘗試配制了一種無(wú)血清培養(yǎng)基。目前，CAF-Clan I和CAF-Clan II已在這種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)了5代。這種改進(jìn)的無(wú)血清培養(yǎng)基的成本是商品化培養(yǎng)基的31.8～47％。
　　論文還對(duì)其他8種重要林木害蟲(chóng)的細(xì)胞系

9、培養(yǎng)進(jìn)行了研究。其中，取自美國(guó)白蛾胚胎的一瓶原代培養(yǎng)細(xì)胞已經(jīng)成功傳了第4代，有望建成1株新的細(xì)胞系。春尺蠖和光肩星天牛等其他林業(yè)昆蟲(chóng)的原代培養(yǎng)還在進(jìn)行中。適合美國(guó)白蛾和春尺蠖細(xì)胞生長(zhǎng)的的培養(yǎng)液是IPL-41＋10％FBS。
　　本研究建立了2株新的鱗翅目昆蟲(chóng)細(xì)胞系，豐富了昆蟲(chóng)細(xì)胞系資源；進(jìn)行了兩種細(xì)胞系復(fù)制楊扇舟蛾顆粒體病毒的試驗(yàn)，表明其對(duì)病毒敏感，具有良好的體外復(fù)制該顆粒體病毒的前景；再者，本研究中研制的無(wú)血清培養(yǎng)液具有良好的應(yīng)