利用WISH技術(shù)研究斑馬魚(yú)TMP3和FHLA基因在心臟和骨骼肌發(fā)育中的作用.pdf

1、脊椎動(dòng)物的心臟是最早出現(xiàn)并表現(xiàn)出功能的器官之一。它的發(fā)育過(guò)程極其復(fù)雜，受到一系列心臟發(fā)育相關(guān)基因的精確調(diào)控。這些基因發(fā)生異常將會(huì)導(dǎo)致先天性心臟病，嚴(yán)重的將會(huì)導(dǎo)致胚胎的死亡。目前對(duì)心臟發(fā)育過(guò)程中牽涉到的分子機(jī)制仍然不清楚，因此，研究調(diào)控心臟發(fā)育候選基因的功能及其作用的分子機(jī)制具有重要的理論與臨床應(yīng)用意義。本文以斑馬魚(yú)為模式生物，利用原位雜交技術(shù)研究了TMP3對(duì)心臟發(fā)育及FHLA對(duì)骨骼肌發(fā)育的作用。
　　TMP3在心臟和肌肉中特異性高

2、表達(dá)，其是否影響心臟的發(fā)育尚不得而知。本文以斑馬魚(yú)為模型，利用整體胚胎原位雜交技術(shù)(WISH)對(duì)其在心臟發(fā)育中的功能進(jìn)行了研究。我們首先用報(bào)告基因EGFP為探針，在斑馬魚(yú)TMP3-enhancer品系中做原位雜交，得到了TMP3基因的胚胎表達(dá)譜。接著以心房標(biāo)記基因amhc為探針，在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育22ss，24hpf和48hpf階段做原位雜交，結(jié)果顯示:敲低TMP3導(dǎo)致心房變小，共注射TMP3 mRNA能拯救TMP3敲低導(dǎo)致的心房變小表型

3、。由于我室證明TMPA4是TMP3相互作用蛋白，我們對(duì)TMPA4進(jìn)行了Morpholino敲低研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低TMPA4導(dǎo)致與TMP3相似的心房變小的心臟畸形，共注射TMPA4 mRNA能拯救TMPA4敲低導(dǎo)致的心房變小表型。我室也證明GATA4是TMP3的直接靶基因。我們以GATA4為探針對(duì)5ss胚胎發(fā)育階段的原位雜交結(jié)果顯示:過(guò)表達(dá)GATA4也能拯救單敲低TMP3、TMPA4以及共敲低TMP3和TMPA4引起的GATA4表達(dá)下調(diào)的

4、表型。進(jìn)一步分別用心臟標(biāo)記基因cmlc2，心室標(biāo)記基因vmhc和心房標(biāo)記基因amhc標(biāo)志為探針進(jìn)行分析的結(jié)果顯示:GATA4確實(shí)能拯救單敲低TMP3和TMPA4以及共敲低TMP3和TMPA4導(dǎo)致的心臟變小的表型。
　　人類FHL1基因與骨骼肌疾病的發(fā)生相關(guān)。斑馬魚(yú)FHLA基因是其同源基因，其是否影響骨骼肌的發(fā)育未知。我們首先合成了FHLA探針，在斑馬魚(yú)中做原位雜交，本文結(jié)果顯示，在體節(jié)發(fā)育時(shí)期，F(xiàn)HLA在骨骼肌特異表達(dá)。敲低FHL

5、A將會(huì)導(dǎo)致骨骼肌的發(fā)育出現(xiàn)異常。注射FHLA mRNA能夠拯救該缺陷表型。那么，骨骼肌的異常是否是由慢肌發(fā)育異常引起的呢？于是，我們用用F59和4D9抗體做胚胎抗體染色，結(jié)果顯示:FHLA是慢肌發(fā)育所必需的，但不影響慢肌前體細(xì)胞。因?yàn)樾l(wèi)星細(xì)胞是出生后動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)和再生的主要細(xì)胞來(lái)源，而pax7在衛(wèi)星細(xì)胞系的特化過(guò)程中是必不可少的，因此我們用pax7抗體做了胚胎抗體染色，結(jié)果顯示FHLA影響衛(wèi)星細(xì)胞的發(fā)育。最后，我們的結(jié)果還顯示RA信號(hào)