利用斑馬魚模型研究HFHG45基因在血祖細胞形成與分化中的作用.pdf

1、在胚胎發(fā)育過程當(dāng)中，血液與血管都起著重要的作用。人類許多疾病的發(fā)生都與血液或血管發(fā)育異常有密切聯(lián)系。血液與血管起源于同一種細胞，稱之為血祖細胞。血祖細胞來源于中胚層，它會分化形成血液祖細胞以及血管祖細胞。血液祖細胞產(chǎn)生的原始血細胞參與初級造血，而血液祖細胞形成的造血干細胞調(diào)控次級造血產(chǎn)生成熟的紅細胞、髓系細胞以及淋巴細胞。血管祖細胞主要分化為血管內(nèi)皮細胞，最后形成動脈、靜脈和淋巴血管等。血液與血管的整個發(fā)育進程是在繁雜而精密的分子信號網(wǎng)

2、絡(luò)的調(diào)控下進行的，任何關(guān)鍵分子調(diào)控異常都可能會導(dǎo)致嚴重的發(fā)育缺陷或重大疾病。到目前為止，調(diào)控造血體系與血管體系發(fā)育的分子機制不是非常清楚，因此研究血液與血管發(fā)育進程的關(guān)鍵分子有助于完善血液與血管發(fā)育過程的分子信號網(wǎng)絡(luò)，從而對有關(guān)疾病的治療提供新的分子靶點和治療方案。
　　本文利用模式生物斑馬魚，研究一個尚未有功能報道的新基因HFHG45對血祖細胞的形成與分化的影響。為了探究HFHG45基因的時空表達譜，分別對斑馬魚發(fā)育各個時期的胚

3、胎進行原位雜交和RT-PCR，分析結(jié)果表明:HFHG45在斑馬魚中廣泛表達且高表達于血液血管處。為了更加直觀觀察HFHG45的表達情況，建立HFHG45啟動子綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系TG(HFHG45:egfp)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):表達綠色熒光區(qū)域基本與原位雜交探針表達區(qū)域接近。研究HFHG45蛋白表達情況，制備了斑馬魚HFHG45多克隆抗體，Western-blot結(jié)果顯示:HFHG45蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育的各時期均表達;在成年斑馬魚的心

4、臟、血液、腦和肌肉組織有表達且在血液中的表達較強烈，這些結(jié)果提示:HFHG45基因可能與斑馬魚血液發(fā)育有關(guān)。利用斑馬魚HFHG45基因特異性的morpholino反義寡核酸敲減其表達，發(fā)現(xiàn)斑馬魚血管與血液發(fā)育異常。為了深入研究HFHG45基因的生物學(xué)功能，運用TALEN敲除技術(shù)得到3個斑馬魚HFHG45基因的敲除品系，敲除系F2代致死分析表明HFHG45基因敲除純合子突變致死;敲除系的表型分析發(fā)現(xiàn)斑馬魚節(jié)間血管、尾部動脈和靜脈發(fā)育受到抑

5、制以及血細胞數(shù)目明顯減少。以上結(jié)果表明HFHG45基因在斑馬魚血液與血管形成中起著十分重要的作用。
　　該基因是怎樣影響斑馬魚血液與血管發(fā)育的呢？首先研究HFHG45基因是否影響斑馬魚的初級造血。胚胎原位雜交檢測血液標(biāo)志基因scl、 mpx、 lcp1和hbbe3;原始紅細胞祖細胞標(biāo)記性基因gata1;原始髓系細胞祖細胞標(biāo)記基因pu.1均在HFHG45敲除純合子中表達顯著下調(diào)，O-Dianisidine染色顯示HFHG45敲除純合

6、子血紅蛋白表達減少。這些結(jié)果表明:HFHG45是直接調(diào)控原始的血細胞發(fā)育的。接下來研究 HFHG45對斑馬魚次級造血的影響。淋巴祖細胞標(biāo)記基因rag1原位雜交結(jié)果顯示:在斑馬魚HFHG45敲除純合子中幾乎沒有rag1的表達，成熟髓系細胞數(shù)目減少。通過中性紅與蘇丹黑染色發(fā)現(xiàn)，髓系細胞分化形成的巨噬細胞和中性粒細胞的數(shù)目都受到了影響。cmyb等造血干細胞標(biāo)記基因的原位雜交以及在TG(cmyb:egfp,kdrl:mCherry)雙轉(zhuǎn)基因斑馬

7、魚中敲除HFHG45表達分析發(fā)現(xiàn)，其背部主動脈中沒有造血干細胞標(biāo)記cmyb的綠色熒光與內(nèi)皮細胞標(biāo)記kdrl的紅色熒光共表達的細胞，實驗證明HFHG45敲除純合子中起源于背部主動脈中的內(nèi)皮細胞沒有正常形成造血干細胞。因此，可以說明:HFHG45是斑馬魚次級造血所必需的。為了研究HFHG45對斑馬魚血管內(nèi)皮細胞的影響，利用TG(flila:egfp）與TG（kdrl:mCherry）2種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，敲除HFHG45基因的情況下分析斑馬

8、魚血管的發(fā)育情況，其熒光表達直觀清楚地顯示敲除HFHG45導(dǎo)致斑馬魚節(jié)間血管、尾部主動脈和靜脈的形成受到明顯抑制。內(nèi)皮細胞標(biāo)記基因flk1、tie2和flila等原位雜交結(jié)果顯示HFHG45基因敲除純合子中它們的表達均顯著減少。這些結(jié)果說明:HFHG45基因在斑馬魚血管的形成中起著重要的作用。
　　已知斑馬魚血細胞和血管內(nèi)皮細胞都起源于血祖細胞，那么HFHG45基因是否直接影響血祖細胞的發(fā)育從而影響血液與血管的發(fā)育呢？血祖細胞標(biāo)記

9、基因scl、 gata2、etv2和gata5原位雜交發(fā)現(xiàn)敲除HFHG45基因的斑馬魚胚胎，血祖細胞的發(fā)育與分化受到嚴重影響。實驗結(jié)果說明:HFHG45基因是通過影響血祖細胞的形成，進而影響血細胞和血管內(nèi)皮細胞的形成。
　　在HFHG45基因敲除斑馬魚中，研究還發(fā)現(xiàn)72h斑馬魚心臟出現(xiàn)了環(huán)化的異常。斑馬魚心臟生理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的心臟功能受到了影響。那么HFHG45基因是直接參與調(diào)控斑馬魚心臟的發(fā)育還是由于血液與血管的異常發(fā)育造

10、成的間接影響呢？心臟早期標(biāo)記基因的RT-PCR結(jié)果表明，敲除HFHG45基因?qū)π呐K祖細胞標(biāo)記基因nkx2.5、tbx5等表達沒有顯著變化。心房標(biāo)記基因amhc、心室標(biāo)記基因vmhc、心臟標(biāo)記基因myl7和bmp4的原位雜交結(jié)果也顯示這些基因的表達沒有改變。綜上所述結(jié)果推測，HFHG45基因可能是間接調(diào)控斑馬魚的心臟發(fā)育。
　　本論文研究結(jié)果表明，斑馬魚HFHG45基因是控制血祖細胞形成與分化的必需調(diào)控因子。它參與調(diào)控斑馬魚造血系統(tǒng)