羅非魚Lysozyme-C3基因在斑馬魚中的轉(zhuǎn)植研究.pdf

1、羅非魚隸屬于鱸形目(Percifomes)、麗魚科(Cichlidae)、羅非魚屬(Tilapia),是我國重要養(yǎng)殖魚類之一。近年廣東、海南、福建和廣西等地區(qū)養(yǎng)殖羅非魚爆發(fā)鏈球病,使我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展受到了嚴重威脅,因此提高羅非魚的抗病能力成為迫切需要解決的問題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為魚類育種開辟了新的途徑。本研究通過比較、篩選出對無乳鏈球菌具有較強溶菌作用的羅非魚Lysozyme-C3基因,利用本實驗室已分離到的誘導型羅非魚Hsp70基

2、因啟動子,構(gòu)建了羅非魚Lysozyme-C3基因表達載體并進行顯微注射,觀察轉(zhuǎn)植基因在斑馬魚中的表達情況,為轉(zhuǎn)基因培育抗病羅非魚的研究奠定基礎。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.幾種魚蝦溶菌酶重組蛋白溶菌活性的比較。采用基因工程重組技術(shù)制備了羅非魚3種C型溶菌酶的重組蛋白,并應用比濁法比較了它們與草魚C型、G型溶菌酶、斑節(jié)對蝦C型溶菌酶重組蛋白對無乳鏈球菌、嗜水氣單胞菌等8種細菌的溶菌作用。結(jié)果顯示6種重組溶菌酶對8種菌均具有溶菌活性,

3、但是溶菌活力強弱不一。羅非魚C3溶菌酶對革蘭氏陽性菌無乳鏈球菌的溶菌作用最強,草魚C型與G型溶菌酶次之;所有重組溶菌酶對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌均具較強的溶菌活性。與斑節(jié)對蝦C型溶菌酶、草魚C型與G型溶菌酶相比,羅非魚的C型溶菌酶對嗜水氣單胞菌具有較強的溶菌作用,且以C1的溶菌活性最強。
　　2.應用金魚Tgf2轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)進行Lysozyme-C3基因的轉(zhuǎn)植研究。金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子是近年在金魚上發(fā)現(xiàn)的具有轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子。本實驗室

4、前期研究中,構(gòu)建了帶羅非魚Hsp70啟動子的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒 pTgf2-Hsp70-eGFP并證實該啟動子具有強誘導活性。本實驗利用高保真酶PCR擴增羅非魚Lysozyme-C3基因開放閱讀框并替換該供體質(zhì)粒中的eGFP基因,獲得pTgf2-Hsp70-C3表達載體。然后設計引物擴增此載體上的Hsp70-C3-SV40片段,并將其插入 pTgf2-Hsp70-eGFP載體的eGFP之后,從而成功構(gòu)建了用于斑馬魚轉(zhuǎn)基因的雙基因表達載體pT

5、gf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3。
　　3.轉(zhuǎn)Lysozyme-C3基因斑馬魚的獲得與檢測。采用顯微注射方法將攜帶Hsp70啟動子、eGFP基因和C3基因的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pTgf2-Hsp70-eGFP-Hsp70-C3和編碼轉(zhuǎn)座酶的mRNA共注射到斑馬魚的受精卵中。注射12h后37℃熱激處理1h,28℃孵育,12h后使用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光表達情況,并挑選出呈綠色熒光的斑馬魚陽性個體。共有580個胚胎孵化出

6、膜,其中有261個胚胎有綠色熒光,熒光率達45％。采用RT-PCR在轉(zhuǎn)基因斑馬魚F1代肝臟、肌肉、腸道、皮膚中均可檢測到eGFP基因mRNA,但僅在肝臟中檢測到Lysozyme-C3基因mRNA。采用 Western blot技術(shù)在轉(zhuǎn)基因斑馬魚 F1代肝臟中均可檢測到 eGFP和Lysozyme-C3蛋白條帶。分析結(jié)果說明,在RNA水平和蛋白水平均能檢測到轉(zhuǎn)植基因的表達,證實轉(zhuǎn)植的羅非魚溶菌酶基因通過轉(zhuǎn)基因首代遺傳到 F1代。進一步比較