大豆疫霉菌低毒力分子機制的初步研究.pdf

1、大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann& Gerdemann)。引起的一種危害嚴重的土傳病害。這種病害可以導(dǎo)致受害大豆產(chǎn)區(qū)高達40％的損失,甚至可能導(dǎo)致大豆產(chǎn)區(qū)絕產(chǎn)。大豆疫霉隸屬卵菌門,在形態(tài)上與絲狀真菌比較相似,但是在進化的角度來說,它與真菌相差甚遠,和藻類同屬于茸鞭生物界,所以它的致病機理跟其他真菌差別很大,目前國內(nèi)外有關(guān)大豆疫霉菌致病機理的研究尚比較少。
　　 本論文以大豆疫霉

2、菌低毒力菌株P(guān)7364L為研究材料,將其與大豆疫霉菌標準菌株P(guān)6497做比較,測定和比較了它們的致病力、菌落生長速率、產(chǎn)孢量、休止率、萌發(fā)率以及孢子囊產(chǎn)量,發(fā)現(xiàn)P7364L與P6497在菌落生長速率、產(chǎn)孢量、休止率等表型上無明顯差異,但是P7364L的孢子囊產(chǎn)量和游動孢子產(chǎn)量明顯低于P6497。在相同游動孢子濃度下,用游動孢子接種感病大豆幼苗Williams下胚軸,發(fā)現(xiàn)P7364L的致病力明顯低于標準的大豆疫霉菌P6497；取侵染后不同

3、時間點的大豆下胚軸表皮進行Trypan blue染色,在顯微鏡下觀察和比較P7364L與P6497的侵染情況,發(fā)現(xiàn)P7364L雖然能正常產(chǎn)生附著胞并成功侵入大豆表皮細胞,但不能在其細胞內(nèi)正常擴展。
　　 為進一步研究P7364L致病力下降的原因,利用先進的Solexa高通量全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和Real-Time RTPCR技術(shù),找到了一批可能與致病力相關(guān)的基因。本研究中分別提取P7364L和P6497在菌絲階段、產(chǎn)游動孢子囊孢階段

4、、侵染1.5小時、侵染6小時、侵染12小時的RNA,反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA,并用于后續(xù)的Real-Time RTPCR和Solexa全轉(zhuǎn)錄組測序工作。Real-Time RTPCR和Solexa結(jié)果均顯示在P.infestans中已經(jīng)證實的游動孢子囊形成調(diào)控基因cdc14和NIFS在本研究的低毒力菌株P(guān)7364L中顯著下調(diào),兩個可能與產(chǎn)孢相關(guān)的cAMP依賴的蛋白激酶基因也有顯著下調(diào)的現(xiàn)象,這些結(jié)果一方面解釋了P7364L產(chǎn)孢子囊顯著減少的

5、原因,另一方面表明本實驗中的研究材料和方法具有很高的可信度。
　　 通過分析和統(tǒng)計Solexa結(jié)果,發(fā)現(xiàn)P7364L中有830個基因顯著下調(diào),有85個基因顯著上調(diào),其中包括一些已經(jīng)證實的致病相關(guān)因子如Cystatin類和Kazal類胞外酶抑制子、以及細胞壁合成相關(guān)的纖維素酶以及幾丁質(zhì)合酶、在真菌中與致病因子外泌密切相關(guān)的Hsp90家族的KAR2與LHS1。同時還發(fā)現(xiàn)P7364L中顯著下調(diào)的基因中多為一些蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子、以及一