蜜蜂白堊病分子診斷技術(shù)的研究.pdf

1、蜜蜂白堊病是一種由真菌蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)寄生而引起蜜蜂幼蟲死亡的傳染性疾病,對(duì)蜂群的群勢(shì)發(fā)展影響極大,在近幾年又呈現(xiàn)出大面積爆發(fā)的趨勢(shì),成為當(dāng)前我國(guó)危害西方蜜蜂最為嚴(yán)重的蜜蜂疾病。目前蜜蜂白堊病的診斷方法主要依賴于典型癥狀和蜜蜂球囊菌的形態(tài)學(xué)特征,費(fèi)時(shí)費(fèi)力且不夠準(zhǔn)確,同時(shí)難以在發(fā)病初期做出準(zhǔn)確診斷。
　　 本文通過參照GenBank數(shù)據(jù)庫里收錄的所列Ascosphaera屬20個(gè)物種的ITS1-5.8

2、S-ITS2 rDNA區(qū)段序列資料,根據(jù)各序列間的保守區(qū)段序列和變化區(qū)段序列設(shè)計(jì)A.apis種的高特異性引物,利用PCR方法體外擴(kuò)增出可作為檢測(cè)A.apis的分子標(biāo)記的DNA片斷,作為診斷蜜蜂白堊病的分子標(biāo)記,并深入研究該分子標(biāo)記特異性、靈敏性和適用性。研究結(jié)果如下:
　　 (1)成功克隆A.apis的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA區(qū)段序列內(nèi)一個(gè)442 bp的特異片段,該DNA片段可以作為蜜蜂白堊病的診斷分子標(biāo)記。

3、>　　 (2)利用該分子標(biāo)記分別檢測(cè)意大利蜜蜂幼蟲、中華蜜蜂幼蟲、毛霉(Mucorracemosus)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、啤酒酵母(Saccharomyces ceravisiae)、大腸桿菌(E.coli)和蜜蜂球囊菌等7種DNA樣品,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有作為對(duì)照的A.apis樣品能成功地?cái)U(kuò)增出400～500 bp的單一條帶;從病蟲尸體分離的毛霉和黃曲霉、啤酒酵母、大腸桿菌、健康蜜蜂幼蟲的DNA樣品均不能擴(kuò)增出

4、相關(guān)產(chǎn)物。這說明該診斷分子標(biāo)記不會(huì)受到其他雜菌和蜜蜂DNA的干擾,對(duì)A.apis具有較高特異性。
　　 (3)通過將A.apis的DNA母液作一系列濃度梯度稀釋,測(cè)定出該診斷分子標(biāo)記的最低檢測(cè)A.apis DNA模板濃度為1.74×10-1ng·μL-1,即在25μL的PCR反應(yīng)體系中加入4.34×10-6ng的A.apis的DNA樣品,檢測(cè)結(jié)果即可呈陽性,可見該診斷分子標(biāo)記的靈敏性是相當(dāng)高的。
　　 (4)利用該診斷分

5、子標(biāo)記對(duì)取自不同蜂群且患病死亡的未經(jīng)分離純化培養(yǎng)的蜜蜂幼蟲蟲尸、無癥狀蜜蜂幼蟲直接進(jìn)行A.apis檢測(cè)。結(jié)果表明,利用該診斷分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確地直接從罹患白堊病死亡蜜蜂幼蟲尸體檢測(cè)出A.apis,不需要經(jīng)過病原菌的分離純化培養(yǎng),具有方便、快捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。同時(shí),該診斷分子標(biāo)記還可以檢測(cè)出無癥狀蜜蜂幼蟲體內(nèi)的病原物A.apis,說明該診斷分子標(biāo)記完全不依賴于癥狀,可望用于蜂群無典型癥狀或癥狀不易發(fā)現(xiàn)的發(fā)病初期或處于潛伏期的病原檢測(cè),對(duì)于蜜蜂

6、白堊病的預(yù)防工作有著積極的應(yīng)用價(jià)值。
　　 (5)根據(jù)上述一系列基礎(chǔ)研究,可以構(gòu)建出一套以PCR為基礎(chǔ)蜜蜂白堊病分子診斷技術(shù),該分子診斷技術(shù)具有準(zhǔn)確、靈敏和快捷的特點(diǎn),完全不依賴于典型癥狀,所以可用于蜂群無典型癥狀或癥狀不易發(fā)現(xiàn)的發(fā)病初期或處于潛伏期的病原檢測(cè)。
　　 (6)利用本研究構(gòu)建的蜜蜂白堊病分子診斷技術(shù)對(duì)所采集到的中華蜜蜂疑似患白堊病蟲尸進(jìn)行病原鑒定和診斷,結(jié)果證明本研究從中華蜜蜂蟲尸上所分離培養(yǎng)的病原真菌菌株