牛布魯氏菌病診斷技術(shù)研究.pdf

1、布魯氏菌?。˙rucellosis，又稱布氏桿菌病、地中海弛張熱、馬耳他熱、波浪熱或波狀熱，簡稱布?。┦怯刹剪斒暇˙rucella）引起的一種變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病。其最早于1887年由 David Bruce在患病死者脾臟中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定。我國則在1905年首次報道該病流行。目前，除少數(shù)發(fā)達國家以外，布病在全球160多個國家流行。布病作為重要的人畜共患病之一，其主要感染牛、羊、豬和犬等動物，其中以牛和羊的感染情況最為嚴(yán)重。布病可通

2、過消化道、皮膚黏膜以及垂直傳播等多種方式引起動物感染，其中最為危險的傳染源為患病的妊娠動物，布魯氏菌可伴隨流產(chǎn)或分娩時的胎兒、胎衣和羊水排出，另外乳汁也是重要的傳染源之一。布病最為顯著的臨床癥狀為生殖障礙，引起懷孕母畜流產(chǎn)，常見于妊娠中后期，且長期不孕；對于公畜來說，則引起睪丸炎和附睪炎，嚴(yán)重影響生殖性能。布病常伴隨著波狀熱、關(guān)節(jié)炎等其他臨床癥狀的發(fā)生。另外，布魯氏菌作為胞內(nèi)寄生菌，一旦感染個體后難以通過抗生素治療，即使動物自愈，仍然有

3、持續(xù)排菌的危險，所以免疫加檢疫是控制和預(yù)防布病的基本方式。目前布病是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的35種傳染病中的乙類傳染病，同時并被列為二類傳染病。
　　目前，對于布病的檢測方法大都建立在體液免疫基礎(chǔ)上，傳統(tǒng)的檢測方法有虎紅平板凝集試驗（RBPT）、試管凝集試驗（SAT）、補體結(jié)合試驗（CFT）等，但傳統(tǒng)方法耗時較長，方法繁瑣且判斷較為困難，結(jié)果判定十分依賴于相關(guān)人員的經(jīng)驗。上世紀(jì)70年代，隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附

4、試驗（ELISA）和熒光偏振實驗(FPA）也被應(yīng)用于布病的檢測之中。然而由于技術(shù)限制，我國使用的動物布病ELISA檢測試劑盒一直被國外廠商壟斷，使得產(chǎn)生了高昂的檢測成本；而且，我國現(xiàn)有的預(yù)防動物布病的疫苗如豬種S2株、牛種A19株和羊種M5株均為光滑型菌株，其免疫后產(chǎn)生的抗體與自然感染之間存在干擾，使得現(xiàn)有手段無法區(qū)分動物的具體狀態(tài)。國外有些國家（如美國、加拿大等）通過使用粗糙型疫苗的方式解決了該問題，但由于我國還未有有效的粗糙型疫苗使

5、用，使得我國對于動物布魯氏菌的有效檢疫和及時淘汰變得更加困難。
　　為了解決上述問題，本研究針分別建立了針對動物布魯氏菌病的競爭ELISA抗體檢測試劑盒和牛布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測方法，同時建立了針對牛布魯氏菌IgM亞型抗體的檢測方法，構(gòu)建了不同感染/免疫狀態(tài)下的動物模型，并借鑒了之前的研究，確定了不同狀態(tài)下牛體液免疫情況，建立了基于牛不同布魯氏菌抗體亞型的鑒別診斷方法。同時，本研究針對現(xiàn)有檢測手段均僅限于檢測體液免疫狀態(tài)

6、的局限，通過對刺激源的選擇，并借鑒牛結(jié)核分枝桿菌病的相關(guān)手段，建立了針對牛布魯氏菌的IFN-γ釋放試驗的檢測方法。
　　本研究通過單克隆細(xì)胞制備技術(shù)篩選到針對布魯氏菌的特異性單抗細(xì)胞株（4C3株），并通過棋盤交叉法確定了包被濃度、酶標(biāo)抗體稀釋度、樣品稀釋度、樣品稀釋液等條件，建立了動物布魯氏菌抗體競爭ELISA檢測方法。在此條件下該方法的敏感性為97.9％，特異性為96.3%。本研究同時以提純的布魯氏菌脂多糖（LPS）抗原，按照上

7、述方法分別建立了針對布魯氏菌特異性IgG和IgM亞型抗體的檢測方法，其敏感性分別達到97.7%和95.7%，特異性分別為95.5%和92%。而且，上述建立的間接ELISA方法對與布魯氏菌具有相同抗原為點的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O:9和大腸桿菌O:157抗血清無交叉反應(yīng)性，證明了本研究建立方法的良好特異性。
　　本研究在建立的分別針對布魯氏菌IgG和IgM抗體亞型檢測方法的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建易感動物（奶牛）模型，獲得我國常用疫苗（豬種布

8、魯氏菌S2弱毒苗和牛種布魯氏菌A19弱毒苗）以及標(biāo)準(zhǔn)強毒株（牛種布魯氏菌2308株）的抗體規(guī)律。通過檢測發(fā)現(xiàn)，S2疫苗口服后在整個檢測期內(nèi)（0~150天）其 IgG的含量均低于臨界值，而IgM則在免疫15天后達到最高，之后逐步下降，并在免疫后60天后低于臨界值；皮下注射A19免疫組其IgG和IgM則在15天后即達到高峰，之后均迅速下降，IgG在感染后90天，IgM則在60天后低于臨界值；與S2組和A19組不同，攻毒對照組其IgG在21~

9、30天時出現(xiàn)后則一直保持穩(wěn)定水平，而 IgM亞型抗體出現(xiàn)時間也比免疫組延遲，迅速達到高峰后持續(xù)下降。這表明不同疫苗之間以及與野毒株之間其抗體亞型有明顯的差別，通過這些區(qū)別，可以通過檢測抗體亞型的方法來對牛群不同狀態(tài)進行鑒別。為了驗證本方法的可行性，本研究對背景清晰的50份樣本進行檢測，通過上述建立的鑒別診斷方法，判斷了其真實狀態(tài)，除個別因處于交叉范圍外，其他樣本（46/50）均可進行實施鑒別診斷，準(zhǔn)確度為92%。本研究通過借鑒牛結(jié)核病的

10、IFN-γ相關(guān)檢測方法，確定了1.0×107CFU/ml的滅活牛種2308抗原作為牛布魯氏菌病IFN-γ釋放試驗的最佳抗原，并對感染牛群進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ釋放試驗可將檢測時間點提前到感染后5天，相較于傳統(tǒng)抗體檢測方法，提前了2~3周。說明該方法可以增強對于布魯氏菌病的檢測效果，對于盡早發(fā)現(xiàn)和處理陽性個體具有重要意義。
　　最后，本研究建立的動物布魯氏菌競爭ELISA檢測方法、牛布魯氏菌間接ELISA檢測方法能夠有效檢測牛