Leptin對雞胚卵黃膜和尿囊膜基因表達(dá)及血管形成的影響.pdf

1、本研究首先發(fā)現(xiàn)狼山母雞蛋白限飼導(dǎo)致子代胚胎發(fā)育遲緩，出雛重降低，同時種蛋中瘦素（leptin）沉積減少，卵黃膜上與激素信號傳遞相關(guān)的基因表達(dá)模式發(fā)生改變，因此推測leptin可能作為一種母源性信號物質(zhì)，通過改變卵黃膜、尿囊膜激素信號傳遞和血管形成相關(guān)基因的表達(dá)和尿囊膜血管的形成，影響雞胚胎發(fā)育。為驗證這一假說，我們分別在肉雞和蛋雞種蛋內(nèi)注射leptin，觀察其對不同品種的雞胚重和出雛重的影響，同時檢測卵黃膜和尿囊膜上相關(guān)基因的表達(dá)以及尿

2、囊膜血管形成的變化；為進(jìn)一步研究leptin對尿囊膜血管形成的影響，我們通過在尿囊膜上直接滴加leptin，以及在蛋雞雞胚尿囊膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中加入leptin，來深入研究leptin對尿囊膜血管形成相關(guān)基因及其蛋白表達(dá)的影響，為揭示母源性leptin影響禽類胚胎生長發(fā)育的機(jī)制提供實驗證據(jù)。
　　 1狼山母雞蛋白限飼對蛋內(nèi)激素沉積和卵黃膜基因表達(dá)以及子代出雛重的影響
　　 選取44周齡狼山雞種母雞（揚(yáng)州家禽研究所）

3、120羽，隨機(jī)分成兩個組，對照組飼喂粗蛋白水平為15％的日糧，試驗組（低蛋白組）飼喂粗蛋白水平為10％的日糧.收集種蛋，部分用于測定卵黃中l(wèi)eptin和皮質(zhì)酮水平，其余在相同的標(biāo)準(zhǔn)條件下孵化，在14胚齡時各組選取10只雞胚稱重并采樣，其余雞胚繼續(xù)孵化，記錄出雛重.采用實時熒光RT-PCR定量卵黃膜、尿囊膜相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，低蛋白組母雞種蛋中沉積的leptin含量顯著減少(P＜0.05)，而皮質(zhì)酮含量沒有顯著變化(P＞

4、0.05)；低蛋白組14胚齡胚重差異不顯著(P＞0.05)，但出雛重顯著低于對照組（P＜0.05）；卵黃膜上與皮質(zhì)酮代謝相關(guān)的酶20-羥類固醇脫氫酶(20-hydroxysteroid dehydrogenase,20HSD)及血管發(fā)生相關(guān)的堿性成纖維細(xì)胞生長因子2（basic fibroblast growth factor2,FGF2）mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial

5、growth factor,VEGF）mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P=0.052)，與瘦素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的瘦素受體（leptin receptor，LepR）、甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的甲狀腺素運(yùn)載蛋白（transthyretin，TTR）mRNA的表達(dá)與對照組相比沒有顯著差異(P＞0.05)；尿囊膜上的20HSD、VEGF、FGF2、LepRmRNA表達(dá)也無顯著變化（P＞0.05）。以上結(jié)果提示：leptin可能作為種蛋中的信號物質(zhì)改變胚膜相關(guān)基因的表

6、達(dá)模式，影響雞胚胎發(fā)育。
　　 2蛋內(nèi)注射leptin對蛋雞和肉雞出雛重、尿囊膜血管形成以及胚外膜相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 為研究leptin對不同品種雞胚胎發(fā)育和尿囊膜血管形成的影響，本實驗分別將萊航蛋雞和羅斯肉雞種蛋隨機(jī)分為兩組，對照組于入孵前在蛋清內(nèi)注射100μL溶劑(PBS),試驗組注射相同體積的0.5μg重組小鼠leptin。于12胚齡稱重、測量胚長，同時采樣用于mRNA的測定，出雛當(dāng)天（0日齡）稱重。在13胚

7、齡時開窗，用等量的甲醇和丙酮固定尿囊膜，將尿囊膜置于顯微鏡下(×40)觀察，隨機(jī)選取相同面積的十個區(qū)域，觀察拍照，用專業(yè)圖象分析軟件(Image-proplus4.5)計算血管的面積。結(jié)果顯示，與對照組相比，leptin處理組蛋雞和肉雞12胚齡胚重、胚長和肉雞的出雛重都無顯著差異（P＞0.05），但蛋雞出雛重顯著降低(P＜0.05)，且只表現(xiàn)在雌性；同時雌性蛋雞的尿囊膜血管面積顯著減少(P=0.037,P＜0.05)，而對雄性無顯著影響

8、；肉雞不論性別尿囊膜血管面積都無顯著變化（P＞0.05）。與對照組相比，leptin處理顯著上調(diào)雌性蛋雞尿囊膜VEGF、LepR和20HSD的mRNA表達(dá)，F(xiàn)GF2mRNA表達(dá)有上調(diào)趨勢(P=0.071)，而雄性尿囊膜只有20HSDmRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)；雌性蛋雞卵黃膜VEGFmRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，雄性的基因表達(dá)均無顯著變化(P＞0.05)。與對照組相比，肉雞尿囊膜LepR、20HSD、VEGF、FGF2m

9、RNA表達(dá)均無顯著差異(P＞0.05)： leptin處理顯著上調(diào)了雄性肉雞卵黃膜的LepR、VEGFmRNA表達(dá)，對20HSD、FGF2mRNA表達(dá)無顯著影響（P＞0.05），雌性卵黃膜基因表達(dá)均無顯著變化.以上結(jié)果提示：leptin對雞胚發(fā)育、尿囊膜血管形成以及胚外膜基因表達(dá)的影響具有品種和性別特異性.蛋雞尿囊膜基因表達(dá)模式的改變和血管生成的變化與蛋雞出雛重降低相關(guān)聯(lián)。
　　 3 Leptin對雞胚尿囊膜血管形成的影響及其機(jī)

10、制
　　 為了進(jìn)一步研究leptin對雞胚尿囊膜血管形成的影響，在7胚齡時給雞胚開窗，第8d在開窗處尿囊膜上放置一個3～4mm直徑的明膠海綿，上面分別滴加2.5pL含0、10、100ngleptin的PBS溶液，2d后觀察載體周圍血管生成的數(shù)量變化情況。同時挑選12胚齡萊航蛋雞雞胚，分離尿囊膜，培養(yǎng)尿囊膜上皮細(xì)胞，分為四組：對照組(PBS)和leptin處理組（1ng/mL,10ng/mL、100ng/mL）.每天換液給予lep

11、tin處理，于72h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA和蛋白。實時熒光RT-PCR定量尿囊膜細(xì)胞上LepR、20HSD、VEGF、FGF2mRNA基因表達(dá)，用Western blot測定LepR、VEGF的蛋白含量。結(jié)果顯示：與對照組相比，滴加10ngleptin，蛋雞尿囊膜中血管及血管總數(shù)明顯減少(P=0.054，P=0.064)，而小血管和大血管數(shù)無顯著變化；雌性蛋雞的中血管、大血管與血管總數(shù)均顯著下降（P=0.011，P=0.014,P=0

12、.044），對雄性來說不論大、中、小血管及血管總數(shù)均無顯著變化；100ng leptin處理蛋雞尿囊膜和10ng leptin處理肉雞尿囊膜，不論性別，對各類血管均無顯著影響。體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，三個劑量的leptin處理24h和48h均不影響細(xì)胞的相對活性，但處理72h顯著抑制細(xì)胞的相對活性，并且濃度越高抑制效果越強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。10、100ng/mL leptin顯著上調(diào)尿囊膜上皮細(xì)胞LepRmRNA表達(dá)（P＜0.05），但L

13、epR蛋白水平反而出現(xiàn)顯著下降（10ng/mL，P=0.029）或下降趨勢(100ng/mL，P=0.078)。三個劑量的leptin處理均顯著上調(diào)VEGF、FGF2mRNA表達(dá)(P＜0.05)，但10和100ng/mL leptin處理的細(xì)胞VEGF蛋白水平呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(P=0.065,P=0.07)。以上結(jié)果提示：胚胎期開窗直接給予10ng leptin，主要影響雌性蛋雞尿囊膜上血管的形成，其機(jī)制可能與leptin顯著抑制體外培養(yǎng)