鴨源雞桿菌的生物被膜形成能力及對(duì)雞原代輸卵管上皮作用的初步研究.pdf

1、雞桿菌屬(Gallibacterium)是革蘭氏陰性巴氏桿菌科中一個(gè)新屬，代表種為鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis，Ganatis)。鴨源雞桿菌是構(gòu)成雞上呼吸道和下生殖道常在菌群的一部分，具有條件致病性，與蛋雞輸卵管炎、輸卵管囊腫及腹膜炎等有關(guān)，引起雞產(chǎn)蛋量下降和死亡。近年來國內(nèi)外雖對(duì)鴨源雞桿菌進(jìn)行了系列研究，但關(guān)于鴨源雞桿菌的體外生物被膜形成條件及其對(duì)雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。因此，為進(jìn)一步揭示鴨源雞

2、桿菌引起雞輸卵管囊腫的相關(guān)機(jī)制，本研究擬探討鴨源雞桿菌的體外生物被膜形成條件和雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，并在此基礎(chǔ)上研究鴨源雞桿菌對(duì)雞的致病性和相關(guān)黏附與侵袋特性，初步揭示鴨源雞桿菌引起蛋雞輸卵管炎和腹膜炎的原因。
　　本文采用體外定量法檢測20株鴨源雞桿菌的被膜形成能力，并對(duì)被膜形成能力較強(qiáng)的1株鴨源雞桿菌在不同條件（培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基質(zhì)、營養(yǎng)條件）下產(chǎn)生生物被膜(Bacterialbiofilm，BF)的差異進(jìn)行了研究。結(jié)

3、果顯示，大部分鴨源雞桿菌具有形成不同程度生物被膜的能力，其中3株被膜形成能力中等，2株形成能力較強(qiáng);鴨源雞桿菌在銀染法、試管和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中形成BF的最佳培養(yǎng)時(shí)間分別是24 h、60 h和24 h。其生長周期為8h開始起始黏附、20 h大量黏附、24 h時(shí)形成完整的生物被膜、32 h生物被膜老化散播，之后起始新一輪的被膜形成周期。葡萄糖、蔗糖及NaCl均在一定程度上抑制了BF的形成，且隨著濃度的增加，NaCl對(duì)被膜形成抑制更顯著，而

4、低濃度的MgSO4在一定程度上促進(jìn)BF的形成。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，生物被膜內(nèi)的菌體聚集成團(tuán)塊狀、相互黏連形成致密的三維立體結(jié)構(gòu)。
　　為探討雞原代輸卵管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，進(jìn)一步研究鴨源雞桿菌對(duì)雞的致病性和相關(guān)侵襲特性，分別對(duì)消化酶、消化時(shí)間、取材部位和表面包被物等條件進(jìn)行比較和優(yōu)化，篩選出雞原代輸卵管上皮細(xì)胞分離和純化的最佳方法，并對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定與傳代。結(jié)果顯示，取雞輸卵管漏斗部，并用0.25％胰酶+0.02％ EDTA聯(lián)合

5、消化15 min、低速離心去除單細(xì)胞、差速貼壁除去成纖維細(xì)胞，在20％ FBS包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中可獲得滿意的輸卵管上皮細(xì)胞分離效果，細(xì)胞貼壁性良好。培養(yǎng)的細(xì)胞在24 h時(shí)成團(tuán)貼壁，48～60 h明顯增殖，呈圓形或多角形“鋪路石樣”的單層細(xì)胞生長，72 h后細(xì)胞增殖速度減慢，可以維持至10 d以上，且2次傳代后細(xì)胞貼壁生長良好。經(jīng)姬姆薩染色和透射電鏡觀察鑒定為雞輸卵管上皮細(xì)胞。本研究建立的雞原代輸卵管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法可獲得純度較高的目

6、的細(xì)胞。
　　為研究鴨源雞桿菌對(duì)雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的作用，分別以細(xì)菌黏附、侵襲試驗(yàn)及借助姬姆薩染色及掃描電鏡觀察2株不同來源的鴨源雞桿菌對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞的黏附和侵襲特性。黏附計(jì)數(shù)表明鴨源雞桿菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附輸卵管上皮細(xì)胞，而菌株F149T對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞有較低的黏附。慶大霉素保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示2株菌對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞均無可見侵襲力。姬姆薩染色及掃描電鏡試驗(yàn)進(jìn)一步證明輸卵管上皮細(xì)胞表面有細(xì)菌黏附，而內(nèi)部未見

7、有侵襲的細(xì)菌，但是Yu-PDS-RZ-1-SLG株接種細(xì)胞90 min后，細(xì)胞逐漸破碎脫落，而菌株F149T則未見明顯細(xì)胞損傷。菌株經(jīng)胰蛋白酶處理后，細(xì)菌的黏附率顯著降低，表明細(xì)菌的表面蛋白參與黏附。ELISA法檢測鴨源雞桿菌感染輸卵管上皮細(xì)胞后炎性細(xì)胞因子的變化，結(jié)果表明感染組的IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均高于對(duì)照組，且Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的細(xì)胞所分泌的各細(xì)胞因子均高于F149T，提示炎性細(xì)胞因子的分泌可能改

8、變局部的微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)菌在輸卵管細(xì)胞表面增殖，是造成輸卵管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。
　　為探索鴨源雞桿菌對(duì)輸卵管上皮細(xì)胞的損傷機(jī)制，分別用體外表達(dá)的溶細(xì)胞毒性的重組蛋白GtxA及其N端與C端結(jié)構(gòu)域作用于輸卵管上皮細(xì)胞，通過CCK-8及細(xì)胞因子檢測試劑盒測定細(xì)胞的受損程度和細(xì)胞因子的變化。結(jié)果表明重組蛋白GtxA不但能夠抑制輸卵管細(xì)胞的增殖，而且表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用，N端結(jié)構(gòu)域作為獨(dú)立的元件不能表現(xiàn)毒性作用，但是能夠促進(jìn)毒素蛋白