“睡美人”轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因在雞輸卵管和睪丸整合表達(dá)特性研究.pdf

1、為了構(gòu)建“睡美人”轉(zhuǎn)座子(Sleeping Beauty transposon，SB)整合型雞輸卵管特異表達(dá)載體，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的雞卵清蛋白基因5'-和3'-調(diào)控區(qū)序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用高保真PCR法從白來航雞基因組DNA中分別擴(kuò)增出長度各為3.0kb的卵清蛋白基因5'-和3'-調(diào)控區(qū)，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入pMD19-T載體，部分序列測(cè)定結(jié)果證明與國外發(fā)表的雞卵清蛋白基因相應(yīng)區(qū)域同源性為100％。將雞卵清蛋白基因5'-和3'-調(diào)控區(qū)克隆入切除C

2、MV啟動(dòng)子和SV40序列的pcDNA3.0載體，獲得的雞輸卵管特異表達(dá)載體命名為pOV。分別將綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因和人乳鐵蛋白(hLF)cDNA通過MIUⅠ位點(diǎn)克隆入pOV載體，獲得重組載體pOV-EGFP和pOV-LF，然后用限制性內(nèi)切酶將OV-EGFP和OV-LF表達(dá)盒從上述兩個(gè)載體中切出，克隆至SB轉(zhuǎn)座子載體pT2/HB的多克隆位點(diǎn)，從而構(gòu)建成表達(dá)EGFP和hLF的整合型雞輸卵管特異表達(dá)載體pT2/HB-OV-EGFP

3、和pT2/HB-OV-LF。
　　 為了證明構(gòu)建的SB整合型載體能有效驅(qū)動(dòng)目的基因在雞輸卵管上皮細(xì)胞中整合表達(dá)，將pT2/HB-OV-EGFP與SB轉(zhuǎn)座酶按比例混和，經(jīng)多聚陽離子(PEI)包裹后，注射至產(chǎn)蛋雞輸卵管膨大部，然后將載體注射雞撲殺，在不同時(shí)間段取輸卵管注射部位，分別用RT-PCR和組織冰凍切片檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，結(jié)果顯示EGFP基因在輸卵管注射部位獲得有效表達(dá)，且注射后45d表達(dá)水平仍較高。提取輸卵管注射部位基因組D

4、NA，用PCR和點(diǎn)雜交檢測(cè)報(bào)告基因的整合，結(jié)果顯示LF基因獲得有效轉(zhuǎn)座整合。為了檢測(cè)hLF cDNA的表達(dá)性能，用上述方法將pT2/HB-OV-LF注射至產(chǎn)蛋雞輸卵管膨大部，在不同時(shí)間段取輸卵管注射部位，RT-PCR和免疫組織化學(xué)檢測(cè)LF結(jié)果表明，hLF基因在輸卵管膨大部獲得正確轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)產(chǎn)物能夠與hLF單克隆抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的整合型輸卵管特異表達(dá)載體不僅能有效驅(qū)動(dòng)目的基因在產(chǎn)蛋雞輸卵管上皮細(xì)胞

5、中表達(dá)，而且能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因與受體染色體的整合，可以用于轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器的研制。
　　 為了進(jìn)一步研究SB轉(zhuǎn)座子能否有效介導(dǎo)目的基因在雞精原干細(xì)胞中發(fā)生轉(zhuǎn)座整合，本研究又構(gòu)建了SB整合型組織特異表達(dá)載體，即用限制性內(nèi)切酶AseⅠ和AflⅡ?qū)MV-EGFP表達(dá)盒從質(zhì)粒pEGFP-N1中切出，克隆至SB轉(zhuǎn)座子載體pT2/HB的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成表達(dá)EGFP報(bào)告基因的整合載體pT2/HB-CMV-EGFP。然后將pT2/HB-

6、OV-EGFP與SB轉(zhuǎn)座酶按比例混和，經(jīng)多聚陽離子(PEI)包裹后，通過睪丸網(wǎng)注射至成年公雞曲精細(xì)管內(nèi)，然后在不同時(shí)間段取睪丸注射部位，分別用冰凍切片、免疫組織化學(xué)和RT-PCR等方法檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)。結(jié)果顯示EGFP基因在曲精細(xì)管獲得穩(wěn)定表達(dá)，注射后40d仍然具有較高表達(dá)水平。提取睪丸注射部位基因組DNA，分別用PCR和點(diǎn)雜交檢測(cè)報(bào)告基因的整合，結(jié)果顯示EGFP基因在注射后不同階段均可獲得轉(zhuǎn)座整合。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究將SB整合