逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備雞輸卵管生物反應(yīng)器的前期探索.pdf

1、基于禽蛋生物反應(yīng)器獨特的優(yōu)點，轉(zhuǎn)基因雞輸卵管生物反應(yīng)器已成為轉(zhuǎn)基因動物和生物制藥研究領(lǐng)域中最有活力的熱點。
　　本研究首先分別探索了17月齡、6-9月齡以及激素刺激的雛雞的輸卵管上皮細胞的原代培養(yǎng)。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、CaCl2轉(zhuǎn)染法以及電擊轉(zhuǎn)染法進行上皮細胞轉(zhuǎn)染條件的摸索，其中以電擊轉(zhuǎn)染法最為有效，可以達到3-5％的轉(zhuǎn)染效率。
　　其次，本研究以增強型綠色熒光蛋白(eGFP)為報告基因，以人類促紅細胞生成素（hEPO）為目的

2、基因。在PCR擴增1.1kb雞卵清蛋白5′調(diào)控序列（OV）、GFP、sGFP、EPO等基因序列基礎(chǔ)上，將上述DNA片段連入pMD-18T載體，經(jīng)篩選得到正確連接方向的重組子后，再經(jīng)酶切、連接后，構(gòu)成調(diào)控序列（OV）與基因片段（GFP、sGFP、EPO）的正確銜接。再通過酶切反應(yīng)，將上述銜接片斷切下，連入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLNCX，構(gòu)建的陽性載體分別命名為pLN-OV-GFP、pLN-OV-sGFP、pLN-OV-EPO。
　　最

3、后，將能夠表達MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）Gag和Pol基因的質(zhì)粒載體以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293細胞，經(jīng)過抗性藥物HisD（L-Histidinoldihydrochloride，L-組氨醇二鹽酸鹽）篩選，提取細胞基因組進行PCR鑒定，得到陽性細胞克隆。再將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLN-OV-GFP、pLN-OV-sGFP經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陽性克隆細胞，經(jīng)G418篩選，提取細胞基因組進行PCR鑒定，得到整合有報告基因的病毒包裝細胞系。