豬PNAS-4基因在細胞中的轉(zhuǎn)錄特征分析.pdf

1、豬PNAS-4基因是通過cDNA宏陣列(Macroarray)技術(shù)從大白母豬妊娠55天的胎兒背最長肌和股二頭肌建立的cDNA文庫中篩選出來的，研究人員在前期研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在胚胎期呈下調(diào)表達模式，而在出生后呈上調(diào)表達，同時該基因在各組織中存在表達量的差異，其中，骨骼肌和淋巴組織中表達量最高，在背膘中也有較高的表達，腎和大腦中表達量最低，推測該基因與豬的肌肉發(fā)育以及脂肪沉積性能有一定的關(guān)系。檢索相關(guān)文獻，在人和鼠中該基因的研究主要集中在

2、腫瘤細胞凋亡與胚胎分化發(fā)育過程中的作用，至于該基因自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征卻并沒有涉及，這成為進一步揭示其功能和利用其進行相關(guān)方面的應(yīng)用的制約因素。有鑒于此，我們希望通過本研究，推進豬PNAS-4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，以期促進該基因的功能研究和利用。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)利用Real-Time PCR檢測了小鼠PNAS-4基因在小鼠成肌細胞C2C12以及小鼠前體脂肪細胞3T3-L1分化過程中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PNAS-4基因

3、在C2C12細胞分化過程中的表達規(guī)律類似該基因在肌肉發(fā)育中的表達規(guī)律，即是分化前期表達量相對維持一個較高水平，在后期表達量呈下降趨勢，和C2C12細胞分化的標志基因MYOD、MYOG的表達趨勢相反。在3T3-L1細胞中未分化時的表達明顯高于分化后，和3T3-L1細胞分化的標志基因C/EBPa、Pparg的表達趨勢相反。
　　 (2)通過長片段PCR技術(shù)獲得含有豬PNAS-4基因5'側(cè)翼序列的片段信息，然后克隆、測序得到豬PNAS

4、-4基因的啟動子。構(gòu)建各種缺失片段雙熒光報告基因質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，找到了該基因的核心啟動子區(qū)-346～-254(翻譯起始密碼子的A設(shè)為+1)。利用啟動子分析軟件TESS對豬的PNAS-4基因核心啟動子中的可能的順式作用元件進行了預(yù)測，并構(gòu)建這些順式作用元件結(jié)合位點突變的報告基因質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染然后，發(fā)現(xiàn)該核心區(qū)域內(nèi)的-307～-298 l0bp預(yù)測Spl結(jié)合位點(命名為Spl.3)對該啟動子活性影響很大。最后通過凝膠阻滯電泳實驗(EMSA)證實

5、了PNAS-4基因啟動子中的Spl.3結(jié)合位點的真實性，由此推斷轉(zhuǎn)錄因子Spl可以通過結(jié)合在Spl.3位點增高PNAS-4基因啟動子活性。
　　 本論文通過實時定量PCR檢測了PNAS-4基因在小鼠成肌細胞C2C12以及小鼠前體脂肪細胞3T3-L1中的表達情況，以驗證其與肌肉發(fā)育脂肪沉積可能的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上對豬PNAS-4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征進行分析。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測結(jié)合啟動子研究經(jīng)典途徑找到了調(diào)控PNAS-4基因基礎(chǔ)表達