AK3基因在細(xì)胞中的過表達(dá)分析.pdf

1、第一部分、AK3基因在細(xì)胞中的過表達(dá)分析
　　目的：為了研究AK3蛋白的生物學(xué)功能,構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-AK3-FLAG并將其轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,通過間接免疫熒光法、免疫共沉淀反應(yīng)來觀察在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)AK3蛋白和Sedlin蛋白的表達(dá)以及定位情況,驗(yàn)證二者之間是否存在相互作用,并利用GST pulldown實(shí)驗(yàn)研究AK3蛋白和Sedlin蛋白在體外是否存在相互作用。
　　方法：設(shè)計AK3的上下游引物,以AK3的全長cD

2、NA序列為模板,PCR擴(kuò)增出AK3序列,將其構(gòu)建到pcDNA3.1真核表達(dá)載體中,將酶切鑒定正確的pcDNA3.1-AK3-FLAG重組質(zhì)粒送到上海生工公司測序,經(jīng)BLAST比對,將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞,觀察AK3在COS7細(xì)胞內(nèi)的空間分布,再與Sedlin共同轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞,觀察AK3與Sedlin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況,單獨(dú)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-AK3-FLAG到HEK293T細(xì)胞,再與pCDGFP-Sedlin共

3、同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,用免疫共沉淀驗(yàn)證兩者是否存在相互作用。GST-Sedlin轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中,成功制備融合蛋白,同時轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-AK3-FLAG到293T細(xì)胞通過GST pulldown技術(shù)檢測兩者在體外相互作用情況。
　　結(jié)果：酶切鑒定與公司測序的結(jié)果表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1-AK3-FLAG構(gòu)建成功。熒光顯微鏡檢測AK3在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布,在細(xì)胞核中無明顯分布。而Sedlin在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中

4、均有分布,二者在COS7細(xì)胞中不存在共定位現(xiàn)象。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明帶FLAG標(biāo)簽的AK3蛋白并不能夠把帶GFP標(biāo)簽的Sedlin蛋白沉淀下來,而在適當(dāng)濃度IPTG誘導(dǎo)下,GST-Sedlin融合蛋白表達(dá)成功,GST pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了體外條件下AK3蛋白并沒有和Sedlin蛋白相互作用。
　　結(jié)論：通過免疫熒光實(shí)驗(yàn),結(jié)果說明了AK3蛋白和Sedlin蛋白在細(xì)胞中不存在共定位現(xiàn)象,而免疫共沉淀和GST pulldown實(shí)驗(yàn)證

5、明了AK3蛋白和Sedlin蛋白在體外和細(xì)胞內(nèi)都不存在相互作用。
　　第二部分、Sedlin點(diǎn)突變體與EBI3相互作用的初步研究
　　目的：為了研究Sedlin點(diǎn)突變體與EBI3之間的相互作用,構(gòu)建pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L,并將pCDGFP-SEDL-D47Y,和pCDGFP-SEDL-S73L轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中觀察其在哺乳動物細(xì)胞中的定位情況并和野生型的進(jìn)行比較。再將帶GFP標(biāo)簽

6、的Sedlin點(diǎn)突變體分別與帶FLAG標(biāo)簽的EBI3蛋白共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中觀察共定位的情況。將其共定位的情況與野生型的Sedlin與EBI3蛋白的共轉(zhuǎn)情況做比較。
　　方法：對Sedlin點(diǎn)突變體蛋白全長的編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的片段酶切回收后插入到帶GFP標(biāo)簽的載體中,構(gòu)建表達(dá)載體pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L,將這兩個質(zhì)粒分別染至COS7細(xì)胞,在熒光顯微鏡下分別觀察pCDGFP-S

7、EDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L在哺乳動物細(xì)胞的定位情況,并比較與野生型的差別。再將pCDGFP-SEDL-D47Y和pCDGFP-SEDL-S73L分別與FLAG-EBI3共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察比較兩組蛋白在細(xì)胞內(nèi)與FLAG-EBI3的共定位情況。
　　結(jié)果：pCDGFP-SEDL-D47Y、pCDGFP-SEDL-S73L真核表達(dá)載體經(jīng)酶切和測序鑒定,各重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。免疫熒光顯微鏡觀察

8、Sedlin蛋白的兩個點(diǎn)突變體和Flag-EBI3蛋白共同轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞中后的情況,觀察結(jié)果表明GFP-SEDL-D47Y與FLAG-EBI3的共定位情況與野生型相似,在核內(nèi)核周都有分布,而SEDL-S73L與EBI3主要共定位于核周。
　　結(jié)論：Sedlin蛋白點(diǎn)突體與EBI3的免疫熒光共定位表明,SEDL-D47Y和EBI3在細(xì)胞內(nèi)存在共定位,且定位情況和野生型相似。而SEDL-S73L和EBI3的共定位主要分布在核周附近