Exploring Ssr Markers Based on the Bes and Est Sequences for the Linkage Map of Citrus.pdf

1、微衛(wèi)星標記現(xiàn)已被廣泛應用于植物生物學以及植物育種學等研究領域,但是目前在柑橘屬植物中所開發(fā)的SSR標記數(shù)量還比較有限。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫中柑橘BAC文庫末端序列(BES序列)和EST序列,開發(fā)了4856對新的柑橘SSR分子引物,并且通過聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗全面評價了這些SSR標記在柑橘及其近緣屬植物種間的通用性、多態(tài)性,及其在柑橘群體遺傳學研究中的應用潛力,利用這些標記,構建了紅橘×枳殼的遺傳連鎖圖譜,具體結果如下:
　　

2、1.利用公共數(shù)據(jù)庫中的BES序列和EST序列,通過Primer3軟件分別設計了1025和3831對SSR引物,成功設計的這些引物對分別占到了預測的SSR位點的85.06％和93.92％。同時我們也發(fā)現(xiàn)在柑橘基因組中富含AT基序。利用400對BES-SSR引物和439對EST-SSR引物在16個柑橘或其近緣種中進行PCR擴增,結果顯示,333對BES-SSR引物(83.25％)和368對EST-SSR引物(83.83％)具有擴增產(chǎn)物。

3、r>　　 2.將含有SSR位點的EST序列和BES序列通過blast搜索,結果顯示2613條EST序列(占總序列76.22％)和236條BES序列(27.03％)能夠找到與其相匹配的已知蛋白序列。功能注釋顯示60.12％的EST序列以及16.38％的BES序列與公共數(shù)據(jù)庫中功能蛋白同源。由于有些序列功能分類并不止一種分類方式,因此在每一功能分類中BES或者EST序列比例總數(shù)并不等于100％。GO分類結果顯示,40.78％的EST-SS

4、R序列和13.52％的BES-SSR序列參與分子功能,43.82％的EST-SSR序列和0.57％的BES-SSR序列分別參與細胞組分,47.17％的EST-SSR序列和11.00％的BES.SSR序列參與生物進程。
　　 3.利用16個不同的柑橘及其近緣屬材料檢測BES-SSR和EST-SSR引物通用性,結果顯示,76.99％的BES-SSR和65.00％的EST-SSR測試引物具有通用性。在BES-SSR和EST-SSR引物

5、中,六核苷酸重復序列基序的SSR引物通用性都是最高的。在所開發(fā)的柑橘EST-SSR引物中,具有多態(tài)性的引物的比例沒有BES-SSR類高。同時我們也發(fā)現(xiàn),利用3’末端EST序列開發(fā)的SSR引物要好于5’末端所開發(fā)的引物。在16個柑橘及其近緣屬中,利用EST-SSR引物所擴增的片段,其序列相似度要高于利用BES-SSR所擴增的片段。EST-SSR引物擴增序列相似度為92％-100％,而BES-SSR所擴增序列相似度為52％-100％。

6、>　　 4.為了評價我們所開發(fā)的兩類SSR引物在構建群體遺傳連鎖圖譜中的效力,利用16個不同基因型柑橘植株,推導得到169個假定組合,我們主要統(tǒng)計了雜合位點百分比,多態(tài)性雜合位點百分比以及圖譜構建能力百分比。BES-SSR類標記的雜合位點百分比在每一柑橘基因型中都高于EST-SSR標記。在各品種間,紅橘和甜橙兩品種雜合比例最高,枳殼雜合比例最低,酸橙居中。我們所用的材料中,也包含種間雜種,例如葡萄柚,枸櫞,柚,紅橘,橘等,他們的多態(tài)性

7、雜合位點比率都很高,適合于遺傳圖譜比較研究。通過比較假定組合中多態(tài)性位點比例,我們認為未來可以構建檸檬和柚,紅橘和枳殼,檸檬和紅橘,柚和檸檬雜交F1代群體,為今后遺傳圖譜比較奠定基礎。
　　 5.利用BES-SSR類引物和EST-SSR引物分別對35個柑橘及其近緣屬材料進行遺傳多樣性分析。結果顯示,兩類引物都可以在35份材料中檢測到遺傳變異,并且都具有高度多態(tài)性。BES-SSR引物產(chǎn)生的confusion probability

8、值較EST-SSR.的低,而confusion probability值與discriminating capacity值呈現(xiàn)負相關,所以與EST-SSR相比,BES-SSR具有較高的鑒別力。每一對引物的limit of discriminatingpower均值與actual discrimination power值很相近。BES-SSR標記產(chǎn)生的effectivenumber of patterns per assay unit(

9、P)值最高,達到27.48。由兩類引物計算得到的total number of effective alleles值,Assay efficiency index,Effective multiples ratio,Marker index都很相近。兩類分子標記在35份柑橘及其近緣屬材料中產(chǎn)生的種系關系圖與前人研究結果相吻合,并且兩類標記產(chǎn)生的聚類圖具有高度一致,只有個別材料在聚類圖中有所不同。
　　 6.在柑橘中,利用SSR分

10、子標記評價其群體遺傳結構等相關研究比較少,本研究比較了BES-SSR和EST-SSR標記在三個群體中的群體遺傳結構,結果顯示,兩類SSR標記產(chǎn)生的群體遺傳參數(shù)在相同群體個體中極其相似。
　　 7.利用本實驗室所構建的紅橘×枳殼雜交群體(102單株),選用1291對SSR標記引物,其中包含了我們所開發(fā)的高效EST-SSR,BES-SSR以及已經(jīng)發(fā)表的SSR標記,構建高密度柑橘遺傳連鎖圖譜,最終有36.64％的SSR引物具有群體作圖

11、能力。在作圖群體中共得到382分離位點,其中有66個位點表現(xiàn)出偏分離,最終選擇313個位點構建雜交群體框架圖。遺傳連鎖分析結果表明,在313個位點中,227個位點是連鎖位點,剩余的86個為不連鎖位點,連鎖位點分布在15個連鎖群中,紅橘×枳的圖譜總長24293.9 mM,平均每位點距離107.02mM。同時我們也將45個偏分離位點添加到圖譜中,并且大部分位點坐落在第一連鎖群中。
　　 本研究中利用公共數(shù)據(jù)庫中柑橘EST序列和克里曼