2005-2008年華東地區(qū)NDV遺傳進(jìn)化分析和代表性毒株感染細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)為能感染多種禽類(lèi)的一種急性、高度傳染性疫病，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副粘病毒科，禽腮腺炎病毒屬，其基因組由單股負(fù)鏈RNA構(gòu)成，基因組結(jié)構(gòu)為3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(

2、L)，其中病毒囊膜表面的兩種糖蛋白F和HN是構(gòu)成NDV致病性的主要分子基礎(chǔ)。本研究對(duì)2005-2008年間分離自華東地區(qū)的79株NDV的F基因和HN基因序列進(jìn)行了測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)分離株在基因型和毒力上具有明顯的多樣性，但基因Ⅶd亞型仍然是我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)基因型；在NDV的遺傳進(jìn)化分析基礎(chǔ)上，選取了三株不同遺傳背景的NDV進(jìn)行體內(nèi)外的致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明：基因Ⅶ型NDV對(duì)鴿、雞和鵝均呈現(xiàn)出高致病性，鴿源Ⅵb亞型NDV具有明顯宿主感染

3、特異性；為了進(jìn)一步探討NDV在細(xì)胞分子水平上的致病機(jī)制以及三株NDV之間的致病性差異，本研究還運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組方法對(duì)上述三株NDV感染細(xì)胞后的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了初步分析。
　　 1.2005-2008年我國(guó)華東地區(qū)新城疫病毒分離株的遺傳進(jìn)化分析
　　 對(duì)2005-2008年間從我國(guó)華東地區(qū)發(fā)病的雞、鵝、鴿等禽類(lèi)中所分離出的79株NDV進(jìn)行了生物學(xué)特性和基因型鑒定。F和HN基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果一致表明：79個(gè)分離株中，有

4、3株弱毒為classⅠ譜系；76株為classⅡ譜系，其中基因Ⅰ型NDV弱毒1株，基因Ⅱ型NDV弱毒12株，基因Ⅲ型NDV強(qiáng)毒2株，基因Ⅵ型中等毒力NDV4株，其它57株NDV強(qiáng)毒分離株均屬于基因Ⅶd亞型。Ⅶd亞型毒株占到了所有分離強(qiáng)毒株的96％以上，表明Ⅶd亞型NDV仍然是我國(guó)當(dāng)前流行的優(yōu)勢(shì)基因型。序列比對(duì)結(jié)果顯示，基因Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分離株與疫苗株V4、La Sota和Mukteswar的同源性分別為99.6％、96.2～99％和9

5、9.9％，由此，這些毒株可能來(lái)源于臨床上廣泛使用的疫苗株；4株基因Ⅵb亞型NDV均為鴿源分離株，暗示該亞型NDV具有強(qiáng)的宿主感染特異性。在遺傳進(jìn)化樹(shù)上，57個(gè)Ⅶd亞型NDV可進(jìn)一步分為Ⅶd1和Ⅶd2兩個(gè)分支，近兩年分離的大多數(shù)毒株屬于Ⅶd2分支，與Ⅶd1分支中NDV相比，Ⅶd2中的NDV在F蛋白分別出現(xiàn)了4處突變：N145K、Q279H、K387R和F512I；在HN蛋白也出現(xiàn)3處突變，分別為：T102I、A118E和T443M。我國(guó)新

6、城疫病毒分離株在毒力與基因型所呈現(xiàn)出的多樣性，為研究不同遺傳背景毒株之間的致病性差異提供了理想的生物材料。
　　 2.不同遺傳背景NDV體內(nèi)外致病性
　　 在NDV的遺傳進(jìn)化分析基礎(chǔ)上選取鵝源毒株JS-5-05-Go(基因Ⅶd亞型)、鴿源毒株WX-10-07-Pi(基因Ⅵb亞型)和雞源毒株JS-7-05-Ch(基因Ⅲ型)三個(gè)不同遺傳背景的NDV進(jìn)行體內(nèi)外的致病性試驗(yàn)。三株不同遺傳背景NDV均以0.01MOI接種量感染雞胚

7、成纖維細(xì)胞(CEF)、鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)和鵝胚成纖維細(xì)胞(GEF)，結(jié)果顯示JS-5-05-Go感染三種細(xì)胞的上清HA峰值均比其它兩株病毒高，WX-10-07-Pi感染后三種細(xì)胞上清HA峰值相同，JS-7-05-Ch感染后三種細(xì)胞上清HA峰值差異顯著；三株NDV感染GEF細(xì)胞崩解過(guò)程均比DEF緩慢。動(dòng)物試驗(yàn)中，我們以上述三株NDV和標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E8經(jīng)自然感染途徑分別感染鴿、SPF雞和鵝三種試驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果顯示，僅JS-5-05-

8、Go和F48E8引起感染鴿的死亡，且只有JS-5-05-Go和WX-10-07-Pi毒株導(dǎo)致鴿泄殖腔出現(xiàn)間歇排毒。WX-10-07-Pi攻毒組鴿泄殖腔排毒時(shí)間最長(zhǎng)、且病毒檢出率較其它組要高，因此與其它基因型NDV相比，基因Ⅵb亞型NDV更易在鴿群中感染傳播。SPF雞感染試驗(yàn)結(jié)果表明，JS-7-05-Ch雖為強(qiáng)毒株，但是對(duì)雞的致病性較弱，但其余3株NDV對(duì)雞的致病力與其毒力呈正相關(guān)。四株NDV對(duì)鵝的致病力差異顯著，致病力從強(qiáng)到弱依次為F4

9、8E8、JS-5-05-Go、JS-7-05-Ch和WX-10-07-Pi，WX-10-07-Pi幾乎不引發(fā)鵝的臨床癥狀；F48E8和JS-5-05-Go試驗(yàn)組在9種臟器組織中病毒檢測(cè)率、喉頭和泄殖腔排毒差異不顯著。
　　 3.不同遺傳背景新城疫病毒感染CEF的比較蛋白質(zhì)組研究
　　 為了在細(xì)胞蛋白水平研究三株不同遺傳背景NDV和宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，本研究以感染了NDV的CEF為研究對(duì)象，采用雙向凝膠電泳(2-D

10、E)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定技術(shù)(MALDI-TOF-MS)的比較蛋白質(zhì)組研究方法，分析三株NDV感染CEF后24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)。雙向凝膠圖譜的差異表達(dá)分析顯示，CEF感染三株NDV后，共有43個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)了顯著的差異表達(dá)，包括持續(xù)上調(diào)、持續(xù)下調(diào)、先期上調(diào)后期下調(diào)以及先期下調(diào)后期上調(diào)四種表達(dá)方式，部分蛋白點(diǎn)在不同的感染組中表達(dá)水平有所差異。采用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜法對(duì)43個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行

11、質(zhì)譜鑒定，結(jié)果成功鑒定了41個(gè)蛋白點(diǎn)，對(duì)應(yīng)39種蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白的功能不同，這些差異表達(dá)蛋白涉及病毒結(jié)構(gòu)蛋白(2％)、細(xì)胞骨架(43％)、應(yīng)激反應(yīng)(10％)、蛋白質(zhì)翻譯和合成(7％)、RNA加工和合成(12％)、能量代謝(7％)、泛素-蛋白酶體途徑(2％)、信號(hào)傳導(dǎo)(12％)以及一些功能未知蛋白(7％)。應(yīng)用Western-blot分析方法驗(yàn)證了β-actin和α-tubulin的蛋白表達(dá)水平，其結(jié)果與2-DE的分析數(shù)據(jù)完全相符。根據(jù)差

12、異表達(dá)蛋白的功能，推測(cè)在新城疫病毒感染細(xì)胞時(shí)，病毒可通過(guò)熱休克蛋白27(HSP27)、硫氧還蛋白域5(TXNDC5)和核磷蛋白(NPM1)等蛋白的上調(diào)表達(dá)來(lái)抑制或延緩細(xì)胞的早期凋亡；同時(shí)，翻譯延長(zhǎng)因子Tu(EF-Tu)和40S核糖體蛋白SA(PRSA)上調(diào)表達(dá)有利于病毒自身蛋白質(zhì)的合成；另外，細(xì)胞對(duì)于NDV的感染也具有一定的防御機(jī)制，熱休克蛋白90kDa(GRP94)上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。
　　 比較蛋白質(zhì)給學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示，

13、不同遺傳背景NDV感染細(xì)胞中部分蛋白的表達(dá)水平存在明顯差異。細(xì)胞微絲蛋白β-肌動(dòng)蛋白(ACTB)和細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型肌動(dòng)蛋白8(ACTG8)、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白核仁素(C23)、含有TPR結(jié)構(gòu)域的小的富含谷氨酰胺的蛋白(SGT)和14-3-3E蛋白(14-3-3E)以及參與蛋白翻譯和合成的TXNDC5等與WX-10-07-Pi本身感染特性有關(guān)；細(xì)胞骨架蛋白中α-微管蛋白(TUBA)、角蛋白19(KRT19)、網(wǎng)素3(PLS3)和肌動(dòng)蛋白加帽蛋白(CA

14、PZA2)，RNA加工蛋白中的不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)以及功能未知的類(lèi)人含46卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCDC46)等與JS-7-05-Ch自身感染特性有關(guān)；而細(xì)胞骨架蛋白中波形纖維蛋白(VIM)和B1-鏈微管蛋白(TUBA1C)、熱應(yīng)激蛋白Grp94、蛋白翻譯蛋白EF-Tu以及早期內(nèi)體抗原1(EEA1)等蛋白表達(dá)水平的變化與JS-5-05-Go本身感染特性有關(guān)。
　　 全文小結(jié)：
　　 (1)2005-2008年間共

15、分離鑒定NDV79株，分離株在基因型和毒力上具有明顯的多樣性?；颌鱠亞型仍然是我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)基因型，該亞型目前已出現(xiàn)了Ⅶd1和基因Ⅶd2兩個(gè)分支。
　　 (2)基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型NDV田間分離株與當(dāng)前使用的疫苗毒株關(guān)系密切，推測(cè)這些田間分離株是疫苗株的變異株。與其它基因型毒株相比，鴿源Ⅵb亞型NDV具有明顯的宿主感染特異性。
　　 (3)本研究首次應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組方法研究不同遺傳背景NDV感染CEF細(xì)胞后的差異表達(dá)的

16、蛋白，質(zhì)譜鑒定41個(gè)差異表達(dá)的蛋白，對(duì)應(yīng)39種差異表達(dá)蛋白。
　　 (4)NDV感染細(xì)胞后改變了細(xì)胞骨架、影響泛素-蛋白酶體途徑的穩(wěn)定、破壞了宿主翻譯機(jī)制、抑制細(xì)胞RNA的加工和能量代謝。
　　 (5)不同遺傳背景NDV感染細(xì)胞后均出現(xiàn)與其本身特性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
　　 (6)NDV除通過(guò)膜融合進(jìn)入細(xì)胞外，還可能通過(guò)胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。與其它兩株病毒相比，胞吞作用在JS-5-05-Go進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中，可以發(fā)揮更長(zhǎng)時(shí)