基因Ⅶd亞型和Ⅳ型NDV感染SPF雞后脾臟的比較蛋白質(zhì)組研究及其對免疫雞的感染性差異.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)強毒引起的能感染多種禽類的急性、高度傳染性疫病。NDV目前只有一個血清型，但在遺傳進化上可將毒株劃分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大分支。ClassⅠ分支有9個基因型，主要以弱毒株形式存在于水禽中。ClassⅡ分支也由9個基因型組成，其中Ⅰ～Ⅳ型和Ⅸ型為早期基因型毒株，Ⅴ～Ⅷ型為晚期基因型毒株。自1926年ND首次爆發(fā)以來，造成四次世界大流行的強毒株和現(xiàn)階段常規(guī)弱

2、毒疫苗株均屬于ClassⅡ分支。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來NDV強毒分離株中都有早期與晚期基因型毒株的存在，但基因Ⅶd亞型NDV在分離毒株中占絕對優(yōu)勢，是當(dāng)前世界流行的主要基因型毒株。與早期基因型強毒株相比，基因Ⅶd亞型NDV對宿主免疫系統(tǒng)的侵嗜力更強，造成的組織損傷主要表現(xiàn)為免疫器官的廣泛、嚴(yán)重的壞死。為了研究Ⅶd亞型NDV對宿主免疫系統(tǒng)侵嗜性增強的分子機制，本文以早期毒株Herts/33和Ⅶd亞型毒株JS-3-05-Ch為模式病毒，以

3、重要免疫器管脾臟為研究對象，對模式病毒感染后雞脾臟的組織病理學(xué)變化進行研究比較，結(jié)合雙向凝膠電泳技術(shù)（two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)鑒定的比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，比較基因Ⅶd亞型NDV和基因Ⅳ型NDV感染SPF雞后脾臟蛋白的表達差異，并對差異表達的蛋白進行功能分析，探討早晚期毒株對免疫系統(tǒng)侵嗜性產(chǎn)生差異的原因。此外，研究了早期基因

4、Ⅳ型毒株和流行毒株對免疫雞群的感染性差異，旨在解析免疫雞群中基因Ⅶd亞型NDV流行的原因。
　　1.基因Ⅶd亞型和Ⅳ型NDV對雞脾臟的感染與致病性分析
　　本實驗選取基因Ⅶd亞型NDV（JS-3-05-Ch株）和基因Ⅳ型NDV（Hert/33株）分別感染SPF雞，觀察兩毒株人工感染SPF雞后，脾臟的大體病變、組織學(xué)變化以及抗原定位。體內(nèi)致病實驗結(jié)果表明，兩毒株人工感染SPF雞后，引起SPF雞的發(fā)病率和死亡率均為100％，均出

5、現(xiàn)了明顯的ND癥狀和病變，但是兩組的死亡時間差異顯著，Ⅶd亞型NDV毒力更強，接種雞的死亡時間早于Hert/33株。兩毒株感染雞脾臟產(chǎn)生的病變存在顯著性差異?；颌鱠亞型NDV感染后，脾臟病變表現(xiàn)為腫大，有明顯白色壞死點及以細(xì)胞變性壞死為特征的廣泛性組織損傷;而基因Ⅳ型NDV感染后，脾臟則沒有明顯的眼觀病變，感染后期脾臟有萎縮趨勢。組織學(xué)變化觀察結(jié)果與大體病變結(jié)果相符，基因Ⅶd亞型NDV感染組的雞脾臟內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重變性壞死，淋巴細(xì)胞顯著

6、減少;而基因Ⅳ型NDV感染組的雞脾臟均沒有出現(xiàn)淋巴細(xì)胞的壞死病變，在雞脾臟中僅表現(xiàn)為動脈周圍淋巴鞘淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。透射電鏡觀察脾臟超微結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，兩種基因型病毒感染后，淋巴細(xì)胞均表現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，但Ⅶd亞型NDV感染組的雞脾臟內(nèi)線粒體的病變較基因Ⅳ型NDV感染組更加顯著。另外，兩個毒株感染組的脾臟中都能檢測到病毒抗原，病毒抗原主要定位于脾臟的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)。熒光定量QRT-PCR檢測感染后脾臟中病毒相對含量的結(jié)果顯示，

7、兩毒株感染組脾臟中的病毒含量在感染后表現(xiàn)出不同的變化趨勢，基因Ⅶd亞型NDV感染雞脾臟中的病毒相對含量明顯高于基因Ⅳ型NDV感染組。
　　2.SPF雞感染Ⅶd亞型和基因Ⅳ型NDV強毒后脾臟的比較蛋白質(zhì)組研究
　　為了進一步研究基因Ⅶd亞型NDV(JS-3-05-Ch株)和基因Ⅳ型NDV(Hert/33株)感染SPF雞后對脾臟的致病特征差異機制，本研究以感染了以上兩種NDV SPF雞的脾臟為研究對象，采用雙向凝膠電泳(2-DE

8、)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒定技術(shù)(MALDI-TOF-MS)的比較蛋白質(zhì)組研究方法，結(jié)合生物信息學(xué)手段，分析兩株NDV感染SPF雞后48h、72h和96h三個時間點脾臟蛋白表達動態(tài)。結(jié)合STRING和IngenuityPathway Analysis(IPA)數(shù)據(jù)庫軟件，對差異蛋白的功能、分類、細(xì)胞定位、可能參與的信號通路以及蛋白質(zhì)相關(guān)功能網(wǎng)絡(luò)等方面進行進一步分析，探討兩種不同基因型NDV強毒感染后引起脾臟中差異表達蛋白的

9、類型和功能，繼而進一步分析基因Ⅶd亞型NDV和基因Ⅳ型NDV引起脾臟病變差異的機制。
　　雙向凝膠圖譜的差異表達分析顯示，蛋白差異表達主要發(fā)生在感染后72h和96h。共有168個蛋白點出現(xiàn)了顯著的差異表達，并且部分蛋白點的表達水平在不同的感染組表現(xiàn)出不同的變化趨勢。采用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜法對168個差異表達蛋白點進行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果成功鑒定了132個蛋白點，對應(yīng)108種蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白的功能不同，這些差異表達蛋白涉及細(xì)胞死

10、亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、應(yīng)激反應(yīng)蛋白、泛素蛋白酶體通路相關(guān)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、翻譯調(diào)節(jié)因子、蛋白質(zhì)翻譯和合成、RNA加工和合成、代謝相關(guān)蛋白、運輸?shù)鞍?、胞吞作用相關(guān)蛋白等。應(yīng)用Western-blot分析方法驗證了β-actin的蛋白表達水平，其結(jié)果與2-DE的分析結(jié)果相符。分析結(jié)果顯示，兩種基因型的病毒均能引起SPF雞脾臟蛋白質(zhì)組發(fā)生比較復(fù)雜的改變，包括誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的天然免疫應(yīng)答、改變細(xì)胞骨架、影響泛素-蛋白酶體通路的穩(wěn)定、細(xì)胞

11、死亡等。但與基因Ⅳ型NDV相比，基因Ⅶd亞型NDV引起了更多脾臟蛋白的差異表達，并且基因Ⅶd亞型NDV造成雞脾臟特征性病變與其誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生更為強烈的宿主天然免疫應(yīng)答，嚴(yán)重影響細(xì)胞骨架系統(tǒng)和UPP通路的穩(wěn)定性，以及引起更為強烈的細(xì)胞凋亡及壞死密切相關(guān)。這些為解釋基因Ⅶd亞型NDV與基因Ⅳ型NDV感染后引起脾臟不同病理學(xué)變化的原因，及基因Ⅶd亞型成為當(dāng)前新城疫病毒優(yōu)勢基因型的生物學(xué)機制提供了線索。
　　3.免疫雞群中基因Ⅶd亞型與Ⅳ型

12、新城疫病毒感染性的差異分析
　　將100只3周齡SPF雞隨機分為3組，組l和組2分別用20μl劑量的基因Ⅶ型NDV油佐劑滅活疫苗（A-Ⅶ株）及雞新城疫油佐劑滅活疫苗（LaSota株）經(jīng)頸部皮下注射免疫，每種疫苗免疫40只SPF雞，免疫后21天，采血分離血清，分別用新城疫病毒A-Ⅶ株、LaSota株抗原檢測血清中HI抗體效價后，每種疫苗免疫組分別經(jīng)肌肉注射1050ELD50的基因Ⅶd亞型強毒株JS-3-05-Ch和基因Ⅳ型強毒株He

13、rts/33株，20只/毒株，攻毒對照組為10只/毒株，攻毒后觀察10天，每天記錄對照組和免疫組的發(fā)病死亡情況，并于攻毒后第3、5、7、9天采集喉頭和泄殖腔拭子，用于病毒分離。結(jié)果顯示，LaSota油苗免疫組雞對JS-3-05-Ch和Herts/33攻毒保護效率分別為80％和95％，表明我國常用疫苗株LaSota對基因Ⅶd亞型流行株的保護率較差，而A-Ⅶ油苗對兩強毒株的攻毒保護率均為100％。免疫攻毒后，基因Ⅶd亞型毒株JS-3-05-

14、Ch攻毒組排毒率明顯高于Herts/33株攻毒組。免疫21d后抗體水平為6-710g2試驗雞的排毒數(shù)據(jù)分分析結(jié)果顯示:組1和組2試驗雞在攻毒后的第3、5、7天，Ⅶd亞型JS-3-05-Ch攻毒組雞的排毒陽性率均高于Herts/33株攻毒組，且攻毒后第5和第7天，在LaSota油苗免疫組中，JS-3-05-Ch感染雞的排毒量明顯高于Herts/33感染雞。
　　另外，取血清抗體HI效價均為610g2的試驗雞30只，分別以強毒株JS-

15、3-05-Ch和Herts/33株攻毒，于攻毒后第3天和第5天采集脾臟組織樣品，檢測免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達情況。結(jié)果顯示:除了IL-10和IFN-γ外，JS-3-05-Ch感染雞脾臟中的IL-1β、IL-6、IL-18、LITAF、IFN-α和IFN-β的表達量均低于Herts/33感染組，這些細(xì)胞因子的聯(lián)合下調(diào)表明與早期基因型毒株相比，Ⅶd亞型NDV對免疫雞的免疫應(yīng)答具有更強的抑制能力，此可能是免疫雞群中感染Ⅶd亞型NDV強毒株的重要

16、原因之一。
　　全文小結(jié)
　　(1)與早期Ⅳ型毒株相比，基因Ⅶd亞型NDV感染SPF雞后能引起脾臟產(chǎn)生嚴(yán)重的廣泛性壞死病變，且可誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)生更加顯著的線粒體病變。
　　(2)強毒NDV的感染能引起宿主產(chǎn)生強烈的天然免疫應(yīng)答，促進脾臟組織細(xì)胞的凋亡和壞死;破壞宿主細(xì)胞骨架;影響泛素-蛋白酶體通路的穩(wěn)定。
　　(3)基因Ⅶd亞型JS-3-05-Ch株造成雞脾臟特征性壞死病變可能與其在脾臟中具有更高的病毒復(fù)制水