免疫抑制性病毒感染對SPF雞脾細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生的影響.pdf

1、多種病毒感染都可能引起禽類的免疫抑制。如馬立克氏病病毒(MDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒(REV)、禽J亞群白血病病毒(ALV-J)、雞傳染性貧血病病毒(CAV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、新城疫病毒(NDV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等。流行病學(xué)調(diào)查表明，免疫抑制性病毒感染在雞群中相當(dāng)普遍，而且這些病毒造成的二重感染及多重感染可能導(dǎo)致更為嚴(yán)重的免疫抑制。免疫抑制病給我國集約化養(yǎng)禽業(yè)帶來了很大危害。 但迄今為止，對上述病毒誘發(fā)

2、免疫抑制的機理，特別是細(xì)胞因子在免疫抑制性病毒感染、發(fā)病及免疫反應(yīng)中發(fā)揮的作用還不清楚。有研究表明，一些病原引起的免疫抑制可能與細(xì)胞因子的分泌水平和表達(dá)異常有關(guān)。其中對于免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子——γ-干擾素(IFN-γ)通常采用反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)在mRNA水平上進(jìn)行檢測，但這種方法只能間接反映病毒感染對脾白細(xì)胞分泌IFN-γ的影響。本研究則是采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對REV、MDV、CAV和ARV

3、感染SPF雞的脾白細(xì)胞分泌的IFN-γ水平進(jìn)行了直接定量研究。分別在REV、MDV、CAV和ARV單獨感染和共感染雞后的不同時間，采集脾臟制備脾白細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)，并比較在脾白細(xì)胞中IFN-γ的分泌水平，以此闡明IFN-γ在REV、MDV、CAV和ARV感染引起的免疫抑制過程中可能發(fā)揮的作用。 采用生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)放大的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法，以鼠抗雞IFN-γ單克隆抗體(mAb)為包被抗體，以針對不同抗原表位的生物素

4、化mAb作為檢測抗體對IFN-γ進(jìn)行定量測定，并對ELISA試驗影響因素進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，在10-1000pg/mL的濃度范圍內(nèi)，IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為r=0.9921。以pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)為包被液包被12h，以1％牛血清白蛋白(BSA)為封閉液，室溫封閉2h，并以含1％BSA的PBS-Tween(PBST)為樣品稀釋液，降低了非特異性吸附，提高了靈敏度。 正常情況下，IFN基

5、因表達(dá)處于抑制狀態(tài)，在誘生劑的誘導(dǎo)作用下可以進(jìn)行表達(dá)。因此，本研究采用雙抗體夾心ELISA對培養(yǎng)的不同種類細(xì)胞在不同誘生劑作用下IFN-γ的分泌水平進(jìn)行了定量檢測，并對影響IFN-γ產(chǎn)量的條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：在刀豆蛋白A(ConA)、植物凝集素(PHA)和ARV這3種誘生劑中，ARV誘生能力最強，ConA次之，PHA最弱；其最佳誘生劑量分別為：ARV104TCID50/mL，ConA30μg/mL，PHA1.5μg/mL。雞脾白細(xì)

6、胞、外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)在同種誘生劑作用下，脾白細(xì)胞IFN-γ分泌量最高。各種細(xì)胞最佳濃度均為3.0×106/mL。脾白細(xì)胞在ConA和PHA刺激下，培養(yǎng)60h時產(chǎn)生的IFN-γ最高；而ARV誘導(dǎo)后48hIFN-γ達(dá)到峰值。研究中還發(fā)現(xiàn)，同種IFN-γ具有啟動效應(yīng)。本研究首次采用ELISA對雞脾白細(xì)胞IFN-γ的分泌水平進(jìn)行了定量檢測，并確定了IFN-γ的最佳誘生條件。 在確定了雙抗體夾心ELI

7、SA可以對誘生雞脾白細(xì)胞中的IFN-γ進(jìn)行定量檢測后，為闡明IFN-γ在免疫抑制性病毒感染、發(fā)病及免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮的作用，分別設(shè)計了下述試驗： 試驗一：對IFN-γ在REV和MDV感染中的潛在作用進(jìn)行了探討。首先檢測了不同病毒感染對脾白細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌水平的影響。5日齡SPF雞接種REV、MDV和REV+MDV，于感染后3d、7d、15d、28d和50d采集脾臟做脾白細(xì)胞培養(yǎng)，并采用雙抗體夾心ELISA檢測IFN

8、-γ水平。IFN-γELISA結(jié)果表明：REV+MDV共感染雞在攻毒后7d，IFN-γ增長了3倍，而REV單獨感染可造成5倍的增長，然后逐漸下降，但直到感染后50d試驗結(jié)束，REV單獨感染組和REV+MDV共感染組的IFN-γ水平仍顯著高于對照組。MDV單獨感染后3d和15d，IFN-γ水平顯著低于對照，以后逐漸恢復(fù)正常水平。隨后又對感染不同病毒的雞脾白細(xì)胞在ConA誘導(dǎo)下的IFN-γ分泌水平進(jìn)行了檢測。未感染雞脾白細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Co

9、nA提高了脾白細(xì)胞分泌IFN-γ的水平，但對于REV和MDV或REV+MDV感染雞來說，加入ConA反而降低了IFN-γ分泌水平，但這種差異不顯著。 試驗二：對REV和ARV感染SPF雞后引起的脾白細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平的變化進(jìn)行了研究。1日齡SPF雞接種REV、ARV和REV+ARV，于感染后3d、5d和46d采集脾臟做脾白細(xì)胞培養(yǎng)，并采用雙抗體夾心ELISA法檢測IFN-γ水平。與對照相比，雞感染REV后脾白細(xì)胞IFN

10、-γ的分泌水平顯著升高。感染后5d，REV單獨感染引起IFN-γ增長了8倍，達(dá)到峰值，然后逐漸下降。ARV單獨感染引起IFN-γ增長了2倍。REV和ARV共感染雞脾白細(xì)胞IFN-γ的分泌量增長了3倍。至感染后46d，共感染和REV單獨感染的IFN-γ水平與對照組相比仍然差異顯著，ARV單獨感染與對照組相比差異不再顯著。 試驗三：對REV和CAV感染SPF雞后引起的脾白細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ水平的變化進(jìn)行了研究。1日齡SPF雞接

11、種REV、CAV和REV+CAV，于感染后3d、7d和21d采集脾臟做脾白細(xì)胞培養(yǎng)，并采用雙抗體夾心ELISA法檢測IFN-γ水平。與對照相比，雞感染REV后脾白細(xì)胞IFN-γ的分泌水平顯著升高。感染后7d，REV單獨感染引起IFN-γ5倍的增長，達(dá)到峰值，然后逐漸下降。CAV單獨感染后21d引起IFN-γ分泌水平下降，與對照相比差異顯著。REV和CAV共感染后7d，雞脾白細(xì)胞IFN-γ的分泌量增長了2倍。至感染后21d，共感染組的IF

12、N-γ水平與對照組相比差異不再顯著。 以上研究結(jié)果表明：REV是IFN-γ的一個強誘導(dǎo)劑，ARV也可誘生較高水平的IFN-γ，但較REV誘生能力弱。REV分別與ARV、MDV或CAV共感染后，脾白細(xì)胞IFN-γ的分泌水平處于單獨感染所刺激脾自細(xì)胞IFN-γ的分泌水平之間，沒有顯示任何疊加作用。ARV、MDV或CAV的共感染反而顯著減弱了REV單獨感染時對脾白細(xì)胞IFN-γ分泌的刺激作用。ConA可輕度刺激正常雞脾白細(xì)胞的IFN-