桑樹sbpase的克隆及黃化型萎縮病對其表達影響的研究.pdf

1、桑樹黃化型萎縮病是桑樹上的主要病害，嚴重制約著蠶業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。經(jīng)研究雖然初步明確了桑黃化型萎縮病病原(植原體)的傳播方式和發(fā)生規(guī)律(范懷忠等，1964)，但因植原體目前還不能人工培養(yǎng)，桑黃化型萎縮病發(fā)生的機理研究并沒有取得實質(zhì)性的進展(Chen T A，1993)。因此，研究景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶對黃化型萎縮病是否具有抵抗作用顯得十分重要。 景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶(SBPase)是卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，調(diào)控碳

2、在淀粉和蔗糖之間的分配，對植物葉片中營養(yǎng)成分的積累至關(guān)重要。因此若能在桑樹中高效表達此基因，可極大的增強桑樹的光合效率，提高桑葉的品質(zhì)，對桑樹病害有一定的抑制作用，從而有利于減輕桑樹病害對蠶業(yè)生產(chǎn)的危害。 本研究以桑樹為材料，利用同源克隆方法和RACE技術(shù)成功克隆出sbpase全長cDNA，并進行了序列分析；探討了桑樹黃化型萎縮病對sbpase的表達以及對桑樹光合特性的影響。主要研究結(jié)果如下： 1．本文以桑樹葉片為材料，

3、用CTAB法提取其總RNA，電泳檢測RNA條帶完整、亮度高。表明用該法提取的RNA純度高，能用于分子克隆等后繼分子生物學實驗。 2．根據(jù)已知的sbpase保守區(qū)設計兼并引物，利用RT-PCR法克隆得到長度為530 bp的基因片段，經(jīng)測序和BLAST分析表明，該片段與已知的其它植物的sbpase具有很高的同源性。分別用3’-RACE和5'-RACE法得到長度為540 bp和600 bp的片段。經(jīng)測序和BLAST分析表明得到桑樹sb

4、pase的3’端序列和5’端序列。 3．將上述三段序列除去重疊區(qū)，拼接后獲得的桑樹sbpase cDNA序列全長為1527 bp，包含一個1179 bp的開放閱讀框，在133 bp處有．ATG起始密碼子，1309 bp處有TAA終止密碼子，編碼393個通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列。將其命名為Msbpase，在GenBank注冊，注冊號為DQ995346。經(jīng)BLAST分析表明該基因與GenBank中擬南芥、菠菜、水稻等的多個sbpase

5、具有較高同源性。 4．通過SwissProt的預測，可以推斷出桑樹 SBPase 蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)。桑樹SBPase由兩個相同的、富含無規(guī)則卷曲、α-螺旋和少量β-折疊的亞基構(gòu)成，相鄰亞基通過二硫鍵連接形成同型二聚體。 5．分別提取病株病葉、病株健葉和健株健葉的總RNA，轉(zhuǎn)膜，根據(jù)克隆的桑樹sbpase序列，合成探針，進行Northern雜交，結(jié)果表明，桑樹感染黃化型萎縮病后，sbpase在葉片中的表達量明顯降低。