桑樹黃化型萎縮病病原及其響應(yīng)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、植原體病害是世界性植物病害,全球范圍內(nèi)均有不同程度的發(fā)生,給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。桑黃化型萎縮病是桑樹上的重大病害,常導(dǎo)致大片桑樹毀滅,嚴(yán)重制約了蠶業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。由于植原體難以培養(yǎng),對(duì)于植原體的研究進(jìn)展緩慢,關(guān)于植原體誘導(dǎo)植物發(fā)病的分子機(jī)制知之甚少。自從植原體基因組序列測(cè)定完成后,基因組學(xué)的研究重心便從揭示植原體的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到從整體水平上對(duì)植原體的生物過(guò)程進(jìn)行研究,特別是對(duì)基因組注解的驗(yàn)證性研究,而蛋白質(zhì)組學(xué)研究便是其中的一項(xiàng)重

2、要的內(nèi)容。近年來(lái)對(duì)于桑樹黃化型萎縮病發(fā)生分子機(jī)制的研究并沒(méi)有取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展,桑樹萎縮病病原響應(yīng)蛋白的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)植原體蛋白質(zhì)組學(xué)及桑樹萎縮病病原響應(yīng)蛋白的研究,以期為從分子水平上揭示桑樹萎縮病的發(fā)生機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。 本研究利用Shotgun策略對(duì)植原體表達(dá)的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析。結(jié)合SDS-PAGE電泳與毛細(xì)管液相色譜.串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),準(zhǔn)確地鑒定了242種植原體蛋白質(zhì),其中包括參與氨基酸合成、細(xì)胞膜、中間

3、代謝、細(xì)胞過(guò)程、能量代謝、不飽和脂肪酸和磷脂的代謝、核苷及核苷酸代謝、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、運(yùn)輸和結(jié)合蛋白和其它功能的相關(guān)蛋白質(zhì)。除了上述已知功能的蛋白外,還鑒定了76種假定蛋白或保守的假定蛋白。所鑒定的蛋白質(zhì)總量占預(yù)測(cè)的植原體蛋白質(zhì)組的35％。如此大通量地對(duì)植原體蛋白質(zhì)組進(jìn)行鑒定國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道,該研究不僅為植原體蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了技術(shù)參考,同時(shí)提供了一個(gè)具有參考價(jià)值的植原體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),為更好地理解植原體的生物過(guò)程的功能和機(jī)制奠定了基

4、礎(chǔ)。 本研究結(jié)合蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù),利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略研究了桑樹受植原體侵染后葉片蛋白表達(dá)譜的變化。利用ImageMasterTM 2D Platinum軟件分析,共檢測(cè)到500多個(gè)葉片可溶性蛋白,發(fā)現(xiàn)有37個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá),其中18個(gè)被下調(diào),19個(gè)被上調(diào)。質(zhì)譜分析共鑒定出18個(gè)蛋白點(diǎn),代表了15種不同的蛋白。被鑒定的蛋白包括Rubisco大亞基、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶、Rubisco活化酶、防御相關(guān)蛋白、蛋

5、白酪氨酸磷酸化酶、NUDIX/mutT類水解酶家族蛋白、成熟酶K、Kunitz型蛋白酶抑制劑-1、20S蛋白酶體亞基、放氧復(fù)合體的33 kDa前體蛋白、蘋果酸脫氫酶、甲硫氨酸亞砜還原酶、Gm-ck32857、F-box蛋白、未知蛋白。這些蛋白涉及到光合作用、氨基酸代謝、核苷酸代謝、信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控、防御應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄等多個(gè)生理過(guò)程。本研究為從分子水平上揭示桑樹萎縮病的發(fā)生機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase

6、)是卡爾文循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶。本研究利用RACE技術(shù)得到桑樹景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全長(zhǎng)cDNA,命名為MSBPase(GenBank登錄號(hào):DQ995346)。MSBPase全長(zhǎng)為1 527 bp,該序列含有一個(gè)1 179 bp的完整開放讀碼框,編碼393個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)理論分子量約為42.6 kDa,等電點(diǎn)為5.85,其氨基酸序列與其它植物中已分離的SBPase有很高的同源性。對(duì)MSBPase編碼的蛋白質(zhì)(命名為MSBPas

7、e)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明,該蛋白富含無(wú)規(guī)卷曲(Coil),高達(dá)64.29％,其次是α-螺旋(Helix),為22.19％,而β-折疊(Strand)只有13.52％。將MSBPase編碼區(qū)插入原核表達(dá)載體pET30a(+),并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株BL21中,經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo),MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表達(dá)。將得到的MSBPase編碼區(qū)插入植物表達(dá)載體pBI121中,構(gòu)建了MSBPase植物表達(dá)載體pBI121-SBP。將植

8、物表達(dá)載體pBI121-SBP,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,轉(zhuǎn)化擬南芥,經(jīng)卡那霉素篩選獲得若干再生植株。經(jīng)Northern和Western雜交分析,證明MSBPase在轉(zhuǎn)基因擬南芥中已成功得到表達(dá)。MSBPase在擬南芥中超表達(dá)可以提高擬南芥葉片的SBPase活性和凈光合速率,葉片淀粉和可溶性糖含量增加,植物生長(zhǎng)旺盛,干物質(zhì)積累增加,開花提前。本研究為桑樹基因工程提供了有效的候選基因,為深入研究SBPase的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

9、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(RCA)廣泛存在于光合生物中,它是一種由核基因編碼的葉綠體蛋白,具有調(diào)節(jié)Rubisco活性的功能。本研究根據(jù)RCA的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增,獲得RCA的基因功能區(qū)的中間片段,利用RACE技術(shù)獲得RCA的基因cDNA的3'端片段。對(duì)獲得的基因片段所編碼的氨基酸進(jìn)行BLAST分析,結(jié)果表明,其與GenBank中報(bào)道的其它植物來(lái)源的RCA有較高的同源性。RCA的部分編碼區(qū)插入原核表達(dá)載體pE