水稻白葉枯病無毒因子Ax21成熟機(jī)理初探.pdf

1、白葉枯病是僅次于稻瘟病的水稻第二大病害，Xa21是最早發(fā)現(xiàn)的白葉枯病抗性基因，具廣譜抗性，其無毒基因ax21在2009年底被確定。ax21翻譯產(chǎn)物Ax21(activator of XA21-mediated immunity)為194個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，包含外泌信號(hào)肽，硫酸化17肽axY(s)22，后續(xù)多肽鏈三個(gè)部分。Ax21是目前發(fā)現(xiàn)首個(gè)直接作用于宿主受體，引發(fā)抗性反應(yīng)的群體感應(yīng)因子，也是革蘭氏陰性菌中首次發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)調(diào)控運(yùn)動(dòng)，生物膜形

2、成，毒力相關(guān)基因表達(dá)的群體感應(yīng)因子。目前，已相繼發(fā)現(xiàn)raxST，RaxP，RaxH等十余個(gè)基因參與Ax21的翻譯及活性調(diào)控。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，Ax21硫酸化17肽是引起水稻抗性的活性物質(zhì)，Ax21的成熟必須經(jīng)N端第22位酪氨酸的硫酸化修飾，Ⅰ類分泌系統(tǒng)(typeⅠ secretion system，TOSS)分泌出胞外，蛋白酶切去后續(xù)多肽鏈等過程。為探究Ax21成熟機(jī)理，我們主要進(jìn)行了三部分的研究工作:Ax21硫酸化部位定位與酶

3、切部位定位;RaxST與Ax21蛋白的表達(dá)純化;農(nóng)桿菌介導(dǎo)SAC基因轉(zhuǎn)化水稻。
　　 研究表明RaxST利用PAPS作為硫酸根的供體催化Ax21的硫酸化。構(gòu)建raxST C端具CFP的單交換載體pSKB4-raxST-CFP，電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)白葉枯病菌PXO99，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得單交叉重組菌株。通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)CFP熒光信號(hào)位于胞內(nèi)，推測(cè)Ax21的硫酸化發(fā)生于白葉枯病菌細(xì)胞內(nèi)。蛋白酶切去后續(xù)多肽是Ax21成熟的必須

4、過程，構(gòu)建了Ax21 C端具GFP的單交換載體pSKB4-ax21-GFP，通過電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)白葉枯病菌PXO99，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選獲得單交叉重組菌株。通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)GFP熒光信號(hào)位于胞內(nèi)，推測(cè)Ax21的蛋白酶切發(fā)生在胞內(nèi)，或GFP的存在影響了Ax21的分泌。
　　 Ax21硫酸化由RaxST催化完成，目前尚沒有對(duì)RaxST的催化活性及反應(yīng)具體條件進(jìn)行分析。我們分別把Ax21與RaxST構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a

5、與pSKB4中，高效表達(dá)Ax21與RaxST蛋白，電泳發(fā)現(xiàn)Ax21與RaxST均存在于包含體。通過尿素溶解，復(fù)性純化，我們得到了較高純度的Ax21與RaxST蛋白，為Ax21體外硫酸化活性分析奠定了基礎(chǔ)。
　　 硫是生命活動(dòng)必須的化學(xué)元素，研究表明許多含硫化合物參與了植物細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng)，大田實(shí)驗(yàn)也表明硫可以誘導(dǎo)植物抗病性的產(chǎn)生。Ax21的成熟也必須經(jīng)歷硫酸化修飾，本實(shí)驗(yàn)室研究表明，施硫量的多少，影響水稻對(duì)白葉枯病的抗性。利用轉(zhuǎn)基