版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、[目的] 構(gòu)建人α-防御素HNP-1成熟肽酵母雙雜交系統(tǒng),以期為鑒定出α-防御素與肺上皮細(xì)胞反應(yīng)的相關(guān)蛋白分子打下基礎(chǔ)。 [方法] 培養(yǎng)HL-60細(xì)胞,提取RNA,RT-PCR擴(kuò)增防御素HNP-1成熟肽的cDNA片段,克隆入pBluescript-SK-Ⅱ質(zhì)粒,測序鑒定。EeoR Ⅰ、Sal Ⅰ雙酶切pBluescript-SK-Ⅱ-HNP-1和酵母表達(dá)載體pGBKT7,回收產(chǎn)物并連接,重組誘餌質(zhì)粒命名為pGBKT7-HNP-1
2、,酶切測序檢測。用醋酸鋰法將重組誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,在SD/Trp<'->,SD/Ade<'->/,Trp<'->,SD/His<'->/Trp<'->),SD/Leu<'->/Trp<'->缺陷性培養(yǎng)基上觀察pGBKT7-HNP-1在AHl09中的表達(dá)情況,檢測誘餌蛋白有無毒性作用和自激活功能。磁珠法提取人肺上皮細(xì)胞A549mRNA,用SMART技術(shù),經(jīng)LD-PCR擴(kuò)增獲得全長ds cDNA,轉(zhuǎn)入酵母菌Y187構(gòu)建A549細(xì)
3、胞cDNA文庫,同時(shí)進(jìn)行文庫滴定和雜交效率測定。將pGBKT7-HNP-1,人A549細(xì)胞ds eDNA及文庫質(zhì)粒pGART7/Rec<'->順序轉(zhuǎn)化酵母菌AHl09,β-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)以及氨基酸營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)雙重篩選陽性克隆。然后用文庫引物進(jìn)行菌落PCR對候選陽性克隆進(jìn)行初步鑒定。 [結(jié)果] 克隆的重組質(zhì)粒pBluescript-SK-Ⅱ-HNP-1,以及亞克隆的重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HNP-1經(jīng)測序鑒定證明其插入片段序
4、列完全正確。pGBKT7-HNP-1轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)AH109,在SD/Trp<'->板上生長良好,在SD/Ade<'->/Trp<'->,SD/His<'->/Trp<'->,SD/Leu<'->/Trp<'->平板上不能生長,且在SD/Trp<'->液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h后,OD600值達(dá)到系統(tǒng)要求。說明誘餌蛋白對酵母菌株AH109不具有毒性,且不具自主激活報(bào)告基因的功能。所構(gòu)建的A549細(xì)胞的cDNA文庫,庫容量為1.7×10<'6
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 構(gòu)建人α-防御素HNP-3成熟肽酵母雙雜交系統(tǒng)及鑒定.pdf
- 表達(dá)豬β防御素2成熟肽重組酵母工程菌的構(gòu)建
- 25469.表達(dá)豬β防御素2成熟肽重組酵母工程菌的構(gòu)建
- 人防御素α-1基因(HNP-1)在綠藻中表達(dá)的研究.pdf
- 雞β-防御素-13成熟肽cDNA的克隆及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá).pdf
- Daintain-AIF-1酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及初步鑒定.pdf
- 人SARP1基因酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建、表達(dá)鑒定及自激活和毒性檢測.pdf
- 50994.人α防御素1hnp1基因乳腺定位表達(dá)載體的構(gòu)建
- 牛外周血單個(gè)核細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定.pdf
- hPER1 bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf
- 藏豬IGF-1成熟肽cDNA的克隆表達(dá)及活性分析.pdf
- 雞AvBD2成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性分析.pdf
- 玉米發(fā)育胚乳的酵母雙雜交cDNA文庫及誘餌載體的構(gòu)建.pdf
- 雞AvBD6成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)及其抗菌活性分析.pdf
- 玉米自交系478葉與根酵母雙雜交文庫的構(gòu)建及評價(jià).pdf
- 酵母雙雜交系統(tǒng)篩選CTCF相互作用蛋白.pdf
- 人骨形成蛋白2和7成熟肽編碼區(qū)基因克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf
- 豬肺組織cDNA文庫的構(gòu)建及APP OmpA酵母雙雜交的篩選.pdf
- 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4成熟肽DNA序列的克隆與表達(dá).pdf
- 酵母雙雜交技術(shù)釣取人UROC28結(jié)合蛋白.pdf
評論
0/150
提交評論