鰻弧菌6個(gè)毒力基因的多重PCR與基因芯片檢測(cè)技術(shù)的建立以及創(chuàng)新檢測(cè)技術(shù)的初步探索.pdf

1、病原弧菌是一種在世界范圍內(nèi)感染淡、海水魚類及其它養(yǎng)殖動(dòng)物的弧菌病,常給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。主要包括鰻弧菌、燦爛弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻膠弧菌和哈維氏弧菌等。其中,鰻弧菌(Vibrioanguillarum)流行區(qū)域廣泛,其致病性是由許多毒力因子相互作用而形成的一套復(fù)雜機(jī)制,這些毒力因子包括質(zhì)粒編碼的鐵吸收系統(tǒng)、細(xì)胞外溶血毒素、細(xì)菌鞭毛蛋白、胞外蛋白酶、細(xì)胞表面成分等。對(duì)各種病原鰻弧菌的檢測(cè)方法有很多報(bào)道,主要有免疫熒光抗體技術(shù)和核

2、酸雜交技術(shù)等,但是免疫熒光抗體技術(shù)需要制備抗血清,核酸雜交技術(shù)靈敏度只有150pg。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖病原信息的不斷豐富,水產(chǎn)養(yǎng)殖病原的診斷技術(shù)不可避免地向著高通量的方向發(fā)展。20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù),是高通量、平行性、低成本的新型分子生物學(xué)技術(shù),是基因功能研究的新一代工具。因此,將該技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害的早期診斷對(duì)養(yǎng)殖業(yè)來(lái)說(shuō)是十分具有意義的。多重PCR是指在一個(gè)單一反應(yīng)體系中加入一對(duì)以上的特異引物對(duì),從而同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)序列

3、的反應(yīng)過(guò)程,能夠節(jié)省時(shí)間和精力。為基因芯片診斷的平行性提供保障,為高通量診斷工作提供便利。
　　 本文針對(duì)基因芯片診斷技術(shù)的研究,通過(guò)優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,包括Mg2+濃度、引物濃度、熱啟動(dòng)酶、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)等,建立了一套對(duì)鰻弧菌6個(gè)毒力基因-vah1、virC、flaA,empA、virA、angM-實(shí)現(xiàn)同步擴(kuò)增的多重PCR和基因芯片技術(shù)。作為多重PCR的模板的鰻弧菌總DNA用酚-氯仿抽提法提取,引物和探針

4、的設(shè)計(jì)是在同一反應(yīng)條件下,確保Tm值相近、引物間無(wú)超過(guò)連續(xù)4個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列、引物內(nèi)部無(wú)發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在多重PCR反應(yīng)的優(yōu)化過(guò)程中,設(shè)定Mg2+濃度梯度(1.6mM-5.2mM)、引物濃度梯度(0.1μM-1.0μM)、退火溫度梯度(50℃-65℃)、循環(huán)數(shù)梯度(20c,25c,30c,35c,40c,45c)以及不同的Taq酶組合。得到優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系為:Mg2+濃度3.6mM,引物濃度-angM0.1μM,vah10.2μ

5、M,flaA0.2μM,empA0.2μM,virC0.4μM,virA1.0μM,退火溫度55.5℃,循環(huán)數(shù)35c。熱啟動(dòng)Taq酶的加入對(duì)多重PCR體系的特異性和反應(yīng)效率有顯著提高。多重PCR的電泳檢測(cè)靈敏度可達(dá)到16fg目的基因,相當(dāng)于4個(gè)拷貝鰻弧菌基因組DNA?；蛱禺愋砸锛尤氲馗咝翗?biāo)記的dUTP擴(kuò)增以標(biāo)記鰻弧菌的待測(cè)目的片斷,標(biāo)記后的多重PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢查。將合成后的探針按照設(shè)定的位置分布用手動(dòng)點(diǎn)樣儀點(diǎn)在尼龍

6、膜上點(diǎn)陣組成寡核苷酸膜芯片。之后將該多重PCR產(chǎn)物配制雜交液與基因芯片進(jìn)行雜交,顯色可觀察到鰻弧菌的6個(gè)毒力基因基因均能特異性顯色,無(wú)其它交叉反應(yīng),表明本文建立的多重PCR結(jié)合基因芯片檢測(cè)技術(shù)可以作為待測(cè)樣本是否含有鰻弧菌該毒力基因的檢測(cè)方法。
　　 目前,創(chuàng)新的核酸擴(kuò)增技術(shù)廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)及其相關(guān)的各個(gè)領(lǐng)域,對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮著巨大的作用。主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù);賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增(HAD)技術(shù);固相P