PRRSVGP5蛋白抗獨特型單鏈抗體的構建表達與鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一種急性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)的危害極大。前期研究發(fā)現感染了PRRSV的豬血清中有兩種不同的抗GP5的自身抗獨特型抗體（auto-Ab2），在針對PRRSV感染的免疫網絡中能起到正向或負向調控作用。前期制備的針對抗PRRSV GP5抗體的單克隆抗獨特型抗體（Mab2-5G2）具有結合Marc-145細胞的功能。單鏈抗體具有免疫原性小，仍保持親本抗體結合抗原的特異親和力；而且

2、分子量小，實質組織穿透力強，血漿半衰期短，因此，單鏈抗體在臨床疾病的研究、診斷和治療方面具有重要的應用價值。為了進一步明確Mab2-5G2結合細胞的功能區(qū)域，需要制備只包含抗體可變區(qū)片段（Fv）的Mab2-5G2單鏈抗體（scFv）。本研究從分泌Mab2-5G2的雜交瘤細胞中提取總RNA，逆轉錄為cDNA，以此為模板擴增出重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因；根據鼠源抗體基因家族可變區(qū)的骨架區(qū)(FR)和互補決定區(qū)(CDR)氨基酸序

3、列特點，設計并合成了抗體重、輕鏈可變區(qū)基因的引物；以cDNA為模板擴增出重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）基因。以VH-linker-VL的形式通過重疊PCR（overlapping-PCR）擴增出scFv基因，基因序列分析表明：VH和VL通過編碼(G4S)3連接肽的45bp基因序列連接在一起構成scFv基因，其全長762bp,VH基因位于linker的上游，長360bp，編碼120個氨基酸；VL基因位于linker的下游，長357

4、bp，編碼119個氨基酸。將scFv與原核表達載體pEasy-E1連接構建原核重組表達質粒pEasy-scFv。將pEasy-scFv轉化受體菌 E.Coli1.BL21（Rosetta）感受態(tài)細胞中，經IPTG誘導成功表達了目的蛋白，表達產物主要以包涵體的形式存在。表達后的蛋白經SDS-PAGE分析，其分子量大約為30KD，與預期大小一致。Ni-resin純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳后轉移到硝酸纖維素膜上，分別用鼠源抗His的單

5、抗和兔源抗體Ab3為一抗（經純化的針對Mab2-5G2可變區(qū)的抗體）進行Western-blot分析鑒定，結果表明scFv蛋白具有良好的免疫原性。純化后的ScFv蛋白用尿素梯度為8mol/L～2 mol/L且PH梯度為6～8.5的復性溶液在16℃條件下進行雙梯度透析復性，每個梯度透析12h；復性后的scFv蛋白能夠具有天然抗體Mab2-5G2的功能可特異性結合Marc-145細胞。分別用Mab2-5G2、scFv免疫新西蘭白兔制備抗血清