血吸蟲(chóng)抗獨(dú)特型抗體np306215;v,hcdr3hil2融合基因的構(gòu)建及表達(dá)

1、南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文血吸蟲(chóng)抗獨(dú)特型抗體NP30 6×VCDR3/hIL-2融合基因的構(gòu)建及表達(dá)姓名：徐瑋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理學(xué)指導(dǎo)教師：馮振卿20030420南京醫(yī)科火學(xué)碩二L 學(xué)位論文( 表的h I L - 2 基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，為便于克隆和表達(dá)，在引物兩端引進(jìn)合適的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。分別以質(zhì)粒p F U W 8 0 —6 x V H C D R 3 、p S S K - I 為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)

2、( P C R ) 。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，將其克隆八p U C m - T v e c t o r ，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。2 ．將通過(guò)P C R 方法體外擴(kuò)增并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的N P 3 0 6 ×V H C D R 3和h l L ．2 基因，先后重組入原核表達(dá)載體p E T - 2 8 “+ ) 相應(yīng)的位點(diǎn)上，構(gòu)建成p E T - 2 8 a ( + ) 一6 x V H C D R 3 ／h l L 一2 表達(dá)載體。3 ．通過(guò)重組

3、克隆的篩選，將構(gòu)建正確的融合基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E ．c o l iB L 2 1 ，I P T G 誘導(dǎo)表達(dá)，S D S ．P A G E 確定分子量和產(chǎn)量，并將表達(dá)產(chǎn)物初步純化。4 ．3 6 只B A L B ／c 小鼠( 6 ～8 周齡，體重1 8 ～2 0 9 ) 隨機(jī)分成3組，每組1 2 只。第一組為對(duì)照組，第二組為融合蛋白組，第三組為N P 3 0 組。在0 ，2 ，4 周分三次免疫，實(shí)驗(yàn)組每鼠腹腔注射融合蛋白l O O g l

4、 ( 2 0 0 1 a g ／m 1 ) ；N P 3 0 組每鼠腹腔注射N P 3 01 0 0 9 l ( 2 0 0 9 9 ／m 1 ) ；對(duì)照組于每只小鼠腹腔注射生理鹽水1 0 0 1 x l 。最后一次免疫后二周，尾蚴腹部皮膚攻擊感染，2 8 天后處死小鼠。經(jīng)門(mén)脈灌注，計(jì)數(shù)每只小鼠的蟲(chóng)荷，計(jì)算減蟲(chóng)率。研究結(jié)果1 ．P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)2 0 0b p 及4 0 0b p 特異性條帶，與預(yù)期大小一致。序列測(cè)

5、定結(jié)果表明，N P 3 06 x V H C D R 3 基因全長(zhǎng)1 8 0 b p ，編碼6 0 個(gè)氨基酸殘基；h l L 一2 基因全長(zhǎng)3 9 9 b p ，編碼1 3 3個(gè)氨基酸殘基，有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵( C y s 5 8 一C y s l 0 5 ) 。2 ．表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)抗生素抗性、藍(lán)白斑篩選、P C R 及行E c o R I 、H i n dI I I ／H i n d I I I 、X h o I ／艮以I 、X h o I