鼻咽癌人源抗獨(dú)特型單鏈抗體DNA疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含鼻咽癌人源抗獨(dú)特型單鏈抗體基因G22的真核表達(dá)載體，鑒定重組質(zhì)粒真核表達(dá)的生物學(xué)活性，并將其制備成基因疫苗進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，為抗鼻咽癌疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。 方法：PCR擴(kuò)增G22 scFv基因，重組至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-G22。將CNE2細(xì)胞經(jīng)熱休克預(yù)處理后，RT-PCR擴(kuò)增人全長gp96基因，重組至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體p

2、cDNA3.1(+)-gp96。經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測定后，用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞，以Western Blotting和流式細(xì)胞術(shù)檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)，進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化和免疫熒光確定G22 ScFv基因表達(dá)的細(xì)胞定位。隨后將重組質(zhì)粒制備成基因疫苗，經(jīng)肌肉注射免疫C57BL/6小鼠。一部分小鼠在末次免疫后15天起取血及脾組織，用間接ELISA、競爭抑制ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測G22 ScFv誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答。另一部

3、分小鼠于末次免疫后1周背部皮下分別接種5×10<'6>野生型CMT-93或轉(zhuǎn)基因CMT-93/G22瘤細(xì)胞，觀察荷瘤小鼠的腫瘤體積大小和生存期。 結(jié)果：酶切鑒定和DNA序列分析證實(shí)，重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-G22和pcDNA3.1(+)-gp96構(gòu)建成功，并經(jīng)Western Blotting和流式細(xì)胞術(shù)等方法驗(yàn)證G22 scFv基因和人全長gp96基因能在真核細(xì)胞中正確表達(dá)。進(jìn)一步用G22 scFv為免疫原，gp96為佐

4、劑，以基因疫苗的形式免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗鼻咽癌特異性抗體，其能競爭性抑制FC2McAb(針對鼻咽癌的單抗)與鼻咽癌細(xì)胞HNE2表面抗原的結(jié)合；可刺激小鼠的脾臟CD4<'+> T細(xì)胞、CD8<'+> T細(xì)胞升高；并對荷瘤小鼠表現(xiàn)免疫保護(hù)效應(yīng)，延長生存期。 結(jié)論：成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-G22，并驗(yàn)證G22scFv基因在真核細(xì)胞中表達(dá)的生物學(xué)活性。通過動物實(shí)驗(yàn)證明G22抗獨(dú)特型單鏈抗體可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液