貝氏隱孢子蟲Rhomboid基因的生物信息學分析及其核酸疫苗的免疫保護效果研究.pdf

1、隱孢子蟲（Cryptosporidium）是一種重要的頂復門原蟲，主要寄生于宿主的呼吸道和消化道上皮細胞，引起隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)。該病在人、動物和自然界中廣泛存在，對免疫功能低下的個體危害尤為嚴重，常導致持續(xù)性腹瀉或營養(yǎng)不良，甚至危及生命。目前，對于隱孢子蟲病尚無有效防治措施，探索候選靶抗原的結構和功能特性，從而制備特異性抗體和疫苗成為了該領域研究的新方向。
　　本研究將GenBank中發(fā)表的C.pa

2、rvum、C.hominis和C.muris的菱形體蛋白基因序列進行比對分析，設計合成該基因保守片段的1對特異性引物，以貝氏隱孢子蟲基因組DNA作為模板，通過PCR擴增出CbROM基因保守片段，采用染色體步移技術獲得基因片段3'端和5'端未知核苷酸序列，對所得序列進行測序并拼接。對所獲得序列的生物信息學分析表明，該基因的開放閱讀框大小為1422bp，編碼473個氨基酸，與C.parvum、C.hominis和C.muris的相應基因進行

3、比對分析發(fā)現，核苷酸同源性分別為68.2％、66.7％、59.6％，氨基酸序列同源性分別為61.8％、68.6％、51.6％?；蛩幋a蛋白質的理論分子量為52.7 kDa，等電點為8.65，是疏水性蛋白質，含有7個串連的跨膜螺旋區(qū)，無信號肽;該基因含有典型的菱形體蛋白相關保守結構域，屬于菱形體蛋白酶家族;功能位點分析結果顯示，CbROM蛋白序列包含6個N-糖基化位點，2個cAMP、cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，8個蛋白激酶C磷酸化

4、位點，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和10個N-豆蔻?；稽c;二級結構中包含α-螺旋38.27％，β-折疊16.70％和無規(guī)則卷曲45.03％。
　　以C.baileyi總RNA為模板，結合RT-PCR和巢氏PCR方法，擴增CbROM基因，克隆至pMD18-T Simple載體，測序鑒定序列正確后，經SacⅠ和KpnⅠ雙酶切，亞克隆至pEGFP-C2真核表達載體，構建pEGFP-CbROM真核表達質粒，采用脂質體介導法，將陽性重組質粒

5、瞬時轉染入CEF細胞;通過共聚焦顯微鏡觀察和Western-Blot檢測，分析CbROM基因在體外表達情況。構建的重組質粒pEGFP-CbROM轉染CEF細胞48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到較強的綠色熒光信號，Western-Blot試驗也成功檢測到了重組質粒在體外的表達產物，在大小約為80 kDa處出現EGFP-CbROM融合蛋白特異性條帶，
　　用已構建的重組質粒pEGFP-CbROM免疫雛雞，觀察其對動物機體誘導產生

6、的免疫應答反應，然后經口接種貝氏隱孢子蟲卵囊進行人工感染，評價該核酸疫苗對貝氏隱孢子蟲感染的免疫保護效果。結果表明，pEGFP-CbROM核酸疫苗可以使疫苗免疫組動物血清中抗體水平和外周血液T淋巴細胞增殖能力與對照組相比顯著提高(P＜0.05)，而外周血液B淋巴細胞增殖能力僅在高劑量(100μg)重組質粒免疫組與不免疫不感染組之間存在顯著差異(P＜0.05)。攻蟲后，中劑量(50μg)和高劑量（100μg）重組質粒免疫組雛雞較其他組相比

7、排卵持續(xù)時間分別縮短2d和4d，疫苗免疫組之間的增重情況無顯著差異(P＞0.05)，但與非核酸疫苗免疫組之間差異顯著(P＜0.05)。
　　綜上所述，本研究首次獲得了CbROM基因全序列，并對其基因特征、理化性質和二級結構等進行預測，成功構建了重組質粒pEGFP-CbROM，并在體外檢測到了融合蛋白的正確表達，使用該重組質粒作為核酸疫苗免疫雛雞，在高劑量（100μg）重組質粒免疫組觀察到試驗動物對貝氏隱孢子蟲感染產生了一定免疫保護