貝氏隱孢子蟲轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染.pdf

1、隱孢子蟲病是重要的人獸共患原蟲病。轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的技術(shù)。運(yùn)用轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建隱孢子蟲轉(zhuǎn)染載體，將會(huì)為研究隱孢子蟲基因功能，篩選藥物靶基因和保護(hù)性抗原基因提供有效的工具。本研究以貝氏隱孢子蟲為模型，以黃色熒光蛋白為標(biāo)記分子構(gòu)建隱孢子蟲轉(zhuǎn)染載體，并通過限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)染方法在雞體內(nèi)建立隱孢子蟲轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。
　　首先，120只雛雞分為5組，分別采用直腸接種子孢子，嗉囊接種卵囊，直腸接種卵囊，嗉囊

2、接種子孢子和嗉囊接種PBS液五種接種方法進(jìn)行接種。在接種后檢測各組排卵囊情況，并取法氏囊和氣管等組織制作組織切片和掃描電鏡切片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嗉囊接種卵囊和直腸接種子孢子兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，相對于嗉囊接種子孢子和直腸接種卵囊組在排卵囊高峰期收集到的卵囊數(shù)量更多，這說明嗉囊接種卵囊和直腸接種子孢子組為本實(shí)驗(yàn)的最佳接種途徑；觀察組織切片和電鏡切片，發(fā)現(xiàn)嗉囊接種卵囊、直腸接種子孢子以及直腸接種卵囊組的法氏囊粘膜層均附著有大量的貝氏隱孢子蟲帶蟲空泡，而僅在

3、嗉囊接種卵囊組的氣管粘膜表面觀察到少量蟲體，感染有卵囊的法氏囊和氣管粘膜層均有不同程度的損傷，這說明不同的接種途徑對貝氏隱孢子蟲不同的寄生部位有著重要的影響。本實(shí)驗(yàn)中直腸接種貝氏隱孢子蟲子孢子和卵囊組的成功感染是首次報(bào)道。
　　其次，選擇微小隱孢子蟲和人隱孢子蟲肌動(dòng)蛋白Actin、組蛋白H4，CP15蛋白調(diào)控序列作為參考，利用 PCR技術(shù)克隆貝氏隱孢子蟲啟動(dòng)子和3'-UTR（untranslated region）序列。結(jié)果，經(jīng)過

4、PCR擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化克隆和測序技術(shù)，我們最后成功獲得了貝氏隱孢子蟲H4基因的啟動(dòng)子序列，長度為1295 bp，序列中含81 bp從起始密碼子開始的編碼區(qū)。另外，成功克隆到貝氏隱孢子蟲H4基因3'端轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控序列，長度為977 bp。
　　最后，將啟動(dòng)子，3'-UTR和黃色熒光蛋白序列插入實(shí)驗(yàn)室原保存的載體上，構(gòu)建了貝氏隱孢子蟲轉(zhuǎn)染載體 pCbHYH，通過菌落 PCR、酶切和測序方法，鑒定了貝氏隱孢子蟲轉(zhuǎn)染載體pCbHYH構(gòu)建的正確性

5、。利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的整合轉(zhuǎn)染的方法實(shí)施轉(zhuǎn)染，直腸接種子孢子和卵囊方式接種雛雞。轉(zhuǎn)染的子孢子或卵囊接種雛雞后，在第7天收集的糞便中檢測到發(fā)光的卵囊，且在接種后第11-13天刮取雞法氏囊粘膜，通過熒光顯微鏡觀察到了發(fā)光的隱孢子蟲蟲體，說明在雞體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　本研究建立了貝氏隱孢子蟲子孢子直腸接種雞的方法，為實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染提供了接種途徑；獲得了貝氏隱孢子蟲轉(zhuǎn)染載體，實(shí)現(xiàn)了雞體內(nèi)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有力的推動(dòng)隱孢子蟲入侵、代