用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的雙順反子載體的構(gòu)建及其應(yīng)用.pdf

1、將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞并獲得表達(dá)外源基因的細(xì)胞系，在生物學(xué)及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。動(dòng)物細(xì)胞被外源基因轉(zhuǎn)化通常是一種低效率的過(guò)程，在幾萬(wàn)或幾十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中僅有少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞可整和外源基因，即使對(duì)于高效率的轉(zhuǎn)化方法，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株也是少數(shù)。如何從大量的未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中選出轉(zhuǎn)化株，是基因轉(zhuǎn)移技術(shù)十分關(guān)鍵的一環(huán)。 傳統(tǒng)的方法中，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因工程的載體通常需要外加一個(gè)遺傳標(biāo)記基因以便于進(jìn)行選擇。例如，利用載體攜帶的抗生素抗性

2、基因，通過(guò)一定濃度的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行一段時(shí)間的加壓培養(yǎng)，然后挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)鑒定獲得所要的細(xì)胞系。但是載體中由于目的基因和抗生素抗性基因分別由不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)，往往不能實(shí)現(xiàn)共同表達(dá)，所以采用傳統(tǒng)的方法獲得表達(dá)目的基因的細(xì)胞系，工作量大，所需時(shí)間也長(zhǎng)。 免疫磁珠分選(MagneticCellSorting，MACS)技術(shù)由于其快速、高效并且具有可供利用的試劑盒等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的分選。此項(xiàng)技術(shù)基于抗體對(duì)細(xì)胞表面抗

3、原的特異識(shí)別，將偶聯(lián)在抗體上的磁珠標(biāo)記在細(xì)胞上，在磁場(chǎng)作用下達(dá)到分離細(xì)胞的目的。我們將MACS分選技術(shù)引入到轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選中，通過(guò)構(gòu)建一個(gè)帶有細(xì)胞表面標(biāo)記基因CD34的雙順反子載體，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞在表達(dá)目的基因的同時(shí)表達(dá)CD34標(biāo)記基因，然后通過(guò)MACS分選來(lái)獲得所需的表達(dá)目的基因的細(xì)胞系。 CD34是屬于Ⅰ型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，主要表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞(hematopoieticstem/progenitorcell，HSC/H

4、PC)上。我們利用從CD34+細(xì)胞中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到CD34的一種人工截短體形式dCD34(delectedvariantofCD34)。將其克隆入pGEM-T-easy載體中，測(cè)序證明其包含了完整的胞外域及跨膜部分，但是缺失了胞內(nèi)域。 為了實(shí)現(xiàn)目的基因與CD34基因的共表達(dá)，我們采用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internalribosomeentrysite，IRES)序列構(gòu)建了雙順反子表達(dá)載體

5、。在上游啟動(dòng)子的控制下，IRES序列及與之相連的基因可同時(shí)轉(zhuǎn)錄，并以不依賴帽的方式啟動(dòng)遠(yuǎn)端mRNA的翻譯，從而在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白。我們將酶切得到的IRES及CD34片段分別連接入pGEM-T-easy載體，然后酶切出IRES-CD34片段，將其克隆入pcDNA3.1(+)載體，構(gòu)建了雙順反子載體p3.1-IRES-CD34。此載體中在多克隆位點(diǎn)后包含了一個(gè)IRES序列及CD34基因，目的基因插入載體的多克隆位點(diǎn)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)

6、染的細(xì)胞在表達(dá)目的基因的同時(shí)表達(dá)CD34基因，然后利用細(xì)胞表面帶有的CD34標(biāo)志，采用免疫磁珠分選的方法得到所需的表達(dá)目的基因的細(xì)胞。 為了驗(yàn)證這個(gè)載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選中的作用，我們選擇了綠色熒光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein，EGFP)基因作為目的基因。利用PCR克隆技術(shù)從載體pIRES2-EGFP擴(kuò)增得到EGFP，插入載體p3.1-IRES-CD34的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了載體p3.1-IRE

7、S-CD34-EGFP。將載體p3.1-IRES-CD34-EGFP利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別采用了MACS分選的方法富集陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)果表明，對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，經(jīng)MACS分選后，收集到的陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞百分率明顯提高，在熒光顯微鏡下觀察，有大于95％的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。流式細(xì)胞儀分析表明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)MACS分選后，陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)CD34(PE陽(yáng)性)的細(xì)胞百分率提高

8、到了88％，表明目的基因與細(xì)胞表面標(biāo)記基因CD34實(shí)現(xiàn)了較好的協(xié)同表達(dá)。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選，亦可得到同樣的結(jié)果。 另外，由于在用MACS分選細(xì)胞時(shí)，如果其中待分選的含特定表面標(biāo)志的細(xì)胞含量太低(例如低于1％)，則經(jīng)過(guò)一次MACS分選只能少量地提高其純度，這時(shí)需要進(jìn)行多次MACS分選才能獲得較純的細(xì)胞。對(duì)于轉(zhuǎn)染效率較低的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選，為了能夠只經(jīng)過(guò)一次免疫磁珠分選即能夠得到較純的目的細(xì)胞，我們利用載體p3.1-IRES-CD

9、34所含有的新霉素(neomycin)基因，采用了一個(gè)改進(jìn)的方法。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)含有較低濃度G418的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，殺死一部分未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，使得表達(dá)目的基因的細(xì)胞比例升高，以提高免疫磁珠分選的分選效率。結(jié)果表明，對(duì)于轉(zhuǎn)染效率較低的細(xì)胞，通過(guò)這種方法，經(jīng)MACS分選后表達(dá)目的基因的細(xì)胞含量可達(dá)到95％以上。 綜上，本課題提供了一種與傳統(tǒng)方法不同的分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法并構(gòu)建了一個(gè)可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選的雙順反子