野生動物隱孢子蟲的鑒定及隱孢子蟲鈣調(diào)蛋白基因的擴增.pdf

1、隱孢子蟲?。–ryptosporidisis）是由隱孢子蟲（Cryptosporidium）引起的一種以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)，且呈世界性分布的人畜共患寄生蟲病，該病嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)，也是人類艾滋病患者的主要致死因素之一。美國疾病預(yù)防控制中心已將其列為B類病原，我國2003年將該病列為重點防范的兩種重要寄生蟲病之一。近年來，隱孢子蟲病研究在病原生物學(xué)、流行病學(xué)、診斷及綜合防治等方面取得許多重要成果。但是由于隱孢子蟲蟲種間形態(tài)差異

2、不明顯，國內(nèi)外又缺少隱孢子蟲統(tǒng)一的分類標(biāo)準，加之近年來分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，隱孢子蟲的新基因型報道不斷出現(xiàn)，從而引起隱孢子蟲種類的分類產(chǎn)生較大的爭議，這給預(yù)防和控制該病帶來了極大困難。目前隱孢子蟲的致病機理尚未完全清楚，同時也缺乏公認有特效的治療該病藥物，因此，篩選有效的藥物來防治該病是目前國內(nèi)外研究的熱點之一。
　　 本課題旨在通過對安徽省某動物園野生動物糞樣中隱孢子蟲的檢測，初步篩選出隱孢子蟲感染陽性野生動物，從陽性野生動物

3、糞樣中分離出隱孢子蟲卵囊，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對所獲卵囊進行鑒定，同時對野生動物源隱孢子蟲鈣調(diào)蛋白基因進行擴增，以期為人畜共患隱孢子蟲病的防治提供理論依據(jù)，也為進一步研究隱孢子蟲的代謝機理奠定基礎(chǔ)。
　　 首先，采用飽和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法對安徽省某動物園232份野生動物糞樣進行檢測，根據(jù)糞樣中隱孢子蟲卵囊的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小、卵形指數(shù)等特征，對駱駝和獼猴源隱孢子蟲種類進行鑒定，初步鑒定出駱駝源隱孢子蟲為安氏隱孢子

4、蟲(Cryptosporidium andersoni)，獼猴源隱孢子蟲為人隱孢子蟲(Chominis)。在本次所檢測的232份野生動物糞樣中，采用飽和蔗糖漂浮法檢測時，草食類動物隱孢子蟲感染率為4.88％(2/41)，靈長類動物隱孢子蟲的感染率為13.64％(6/44)，肉、雜事類動物隱孢子蟲的感染率為9.09％(4/44)，鳥類動物隱孢子蟲感染率為6.80％(7/103)；采用改良抗酸染色法檢測時，草食類動物隱孢子蟲的感染率為7.3

5、2％(3/41)，靈長類動物隱孢子蟲感染率為2.27％(1/44)，肉、雜事類動物隱孢子蟲的感染率為0(0/44)，鳥類動物隱孢子蟲感染率為0.97％(1/103)。而采用飽和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法的總感染率分別為8.19％(19/232)和2.16％(5/232)，經(jīng)差異顯著性檢驗（卡方檢驗），兩種檢測方法差異極顯著(P＜0.01)。用飽和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法檢測隱孢子蟲卵囊，兩種檢測方法發(fā)現(xiàn)駱駝感染強度最高。
　　

6、 其次，采用分子生物學(xué)方法對所分離的隱孢子蟲進行分子鑒定。首先，采用蔗糖密度梯度離心法對分離的隱孢子蟲卵囊進行純化，取純化的卵囊，先用漩渦振蕩器震蕩20min，加2％DTT，再將卵囊置于-70℃冰箱反復(fù)凍融3次，提取其基因組DNA，備用。分別根據(jù)已報道隱孢子蟲18S rRNA序列和HSP70基因序列設(shè)計并合成一對引物用于PCR擴增，對所擴增產(chǎn)物進行序列測定，所得序列經(jīng)生物信息學(xué)方法，采用DNAStar軟件對其序列進行分析，構(gòu)建種系進化樹

7、。結(jié)果表明：采用PCR方法分別擴增出540bp和448bp大小的目的基因片段，序列分析可知，此次所分離的駱駝源隱孢子蟲為安氏隱孢子蟲（C.andersoni）。
　　 最后，采用RT-PCR方法擴增隱孢子蟲鈣調(diào)蛋白基因。首先，提取本次分離的駱駝源安氏隱孢子蟲總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后，根據(jù)已報道的隱孢子蟲鈣調(diào)蛋白基因序列設(shè)計一對引物，擴增目的基因。結(jié)果表明，所擴增目的基因片段大小為297bp，與預(yù)期結(jié)果相一致。