茶樹幼根SET文庫構(gòu)建及茶氨酸代謝相關(guān)基因表達(dá)分析.pdf

1、茶氨酸系茶樹中的特征性非蛋白質(zhì)氨基酸，是構(gòu)成茶葉品質(zhì)的主要成分之一，影響茶葉的滋味品質(zhì)，具有重要的保健功能和藥理作用。目前與茶氨酸代謝相關(guān)的分子機(jī)理還知之甚少。因此，研究茶氨酸代謝途徑上相關(guān)的基因，特別是茶氨酸合成的關(guān)鍵酶基因及調(diào)控因子等，將為進(jìn)一步明晰茶氨酸代謝途徑及利用轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)茶氨酸提供基礎(chǔ)?；诓璋彼岷铣捎诓铇涓恳约巴贫ǖ那绑w物為鹽酸乙胺和谷氨酸鈉，作者先在沙培的龍井43 茶苗培養(yǎng)介質(zhì)中添加茶氨酸合成的前體物激活茶氨酸代謝途徑

2、，然后選取茶氨酸合成器官——茶苗幼根作為試材，構(gòu)建cDNA文庫并進(jìn)行ESTs測(cè)序分析；另一方面，篩選出茶氨酸含量差異的材料，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR初步分析茶氨酸代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)。為今后構(gòu)建基因芯片或數(shù)字化的基因表達(dá)譜來獲取茶氨酸代謝相關(guān)的功能基因、調(diào)控因子以及深入了解茶氨酸合成及相關(guān)氮代謝機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下。
　　 1.由于采用現(xiàn)有的茶樹RNA 提取方法提取茶苗幼根中的RNA 難以取得良好的效果，作者在提取

3、茶苗幼根RNA的過程中，對(duì)幾種RNA 提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示改良的CTAB 法提取茶苗幼根等組織中的RNA 完整性好、純度高，可以滿足構(gòu)建cDNA文庫的要求。
　　 2.以茶苗幼根為材料，采用SMART 技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行了鑒定。
　　 結(jié)果顯示該文庫的重組率為92％，庫容量為5.0×105，平均插入片段長度超過1 kb，可以滿足后續(xù)的大規(guī)模測(cè)序等要求。從文庫中隨機(jī)挑選克隆并從5’端單向測(cè)定5160

4、個(gè)克隆，獲得4860個(gè)有效的ESTs，序列長度從100 至1850 bp，平均長度為617 bp（部分序列已登錄GenBank，登錄號(hào)為GE652554–FE861258）。用Phrap 軟件進(jìn)行拼接，共獲得1809個(gè)unigenes，其中，648個(gè)為contigs，1161個(gè)為singletons；與NCBI的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastX 比對(duì)以及Blast2go 注釋，將已知或推定的功能基因進(jìn)行了分類，并通過Kegg分析其中涉及

5、到次生代謝及氨基酸代謝相關(guān)的基因。結(jié)果顯示，1041個(gè)unigenes（57.6％）相似于已知或推定功能的蛋白（E-value＜1E-5），282個(gè)（15.5％）相似于未知功能的蛋白，486個(gè)（26.9％）沒有比對(duì)上任何蛋白，推定為新的表達(dá)基因。將比對(duì)上的編碼已知或推定功能蛋白的基因進(jìn)一步分類，蛋白質(zhì)合成類別占13.06％，與防衛(wèi)相關(guān)的為8.84％，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白占8.65％。與次生代謝相關(guān)的功能基因占4.52％，其中測(cè)到序列數(shù)量最多的為編碼

6、細(xì)胞色素P450的功能基因，共有7個(gè)；此外，還有編碼黃酮3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、p-香豆酰輔酶A 三羥化酶、花青素 5-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、松柏醇?；D(zhuǎn)移酶及咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶等基因。Kegg pathway分析結(jié)果顯示，與次生代謝相關(guān)的基因主要參與類黃酮、異黃酮、苯丙素、萜類化合物、二萜、花青素、黃酮和黃酮醇的生物合成代謝途徑，其中最主要的是涉及黃酮代謝途徑。與初級(jí)代謝相關(guān)的基因?yàn)?7.39％，其中氨基酸

7、相關(guān)的基因中有涉及氮代謝和茶氨酸合成的谷氨酰胺合成酶、S 腺苷甲硫氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、亞硝酸還原酶及胞質(zhì)氨肽谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶等，主要參與蛋氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和谷胱甘肽等氨基酸的代謝。其他涉及胞內(nèi)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)降解與儲(chǔ)存、能量、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞生長及未知功能基因分別占1.16％、6.63％、4.23％、5.57％、9.70％、7.69％和10.56％。
　　 3.在

8、茶愈傷組織中添加茶氨酸合成的前體物、代謝中間產(chǎn)物及信號(hào)分子等成分，應(yīng)用高效液相色譜分析愈傷組織生長過程中茶氨酸的變化及其在對(duì)照與處理之間的差異。分析了茶苗水培中添加 (NH4)2SO4 誘導(dǎo)前后的茶氨酸含量變化，同時(shí)對(duì)遮陰、遮陰與水楊酸或鹽酸乙胺組合處理以及不同品種的茶苗嫩葉中茶氨酸含量差異也進(jìn)行了初步地探討。試驗(yàn)結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加25mM 鹽酸乙胺后，在茶愈傷組織生長6 d和12 d 時(shí)，與對(duì)照相比，茶氨酸含量增加最為明顯。因此選

9、取對(duì)照和鹽酸乙胺誘導(dǎo)的茶愈傷組織作為差異表達(dá)材料進(jìn)行后續(xù)的候選茶氨酸代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)分析。
　　 4.為了選取合適的內(nèi)參基因來分析前體物誘導(dǎo)及對(duì)照的茶愈傷組織中茶氨酸代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)，作者利用GenBank 上登錄的茶樹基因序列以及通過構(gòu)建文庫測(cè)序所得的基因（具有完整的閱讀框）共7個(gè)持家基因設(shè)計(jì)引物，在分析這些引物的擴(kuò)增效率和特異性后，測(cè)定了它們?cè)诓栌鷤M織生長過程中（對(duì)照和愈傷培養(yǎng)基中添加外源物的情況下）的表達(dá)水平

10、。利用geNorm和NormFinder 軟件分析了這些持家基因的穩(wěn)定性，確定在該條件下合適的內(nèi)參基因?yàn)棣?actin和GAPDH。
　　 5.選取11個(gè)推定的與茶氨酸代謝相關(guān)的基因，利用Primer premier 5設(shè)計(jì)引物，利用qRT-PCR定量分析它們?cè)诓璋彼岷坎町惷黠@的茶愈傷組織中表達(dá)量的差異。
　　 試驗(yàn)結(jié)果顯示：GS1-1、gogat、NIR和GDH2在愈傷組織培養(yǎng)初始3 d的表達(dá)量在處理組被明顯地誘導(dǎo)，