A亞群禽白血病病毒不同分離株的基因組和生物學(xué)特性比較.pdf

1、過(guò)去十幾年，ALV-J亞群病毒對(duì)肉用型雞、蛋用型雞和我國(guó)地方品系雞的感染已經(jīng)給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。近兩年，雞白血病/血管瘤病例的顯著上升使該病成為危害我國(guó)蛋雞業(yè)的主要疫病之一。病毒分離鑒定表明，血管瘤的發(fā)生不僅由J亞群禽白血病病毒引起，同時(shí)也有由A、B亞群禽白血病病毒感染引起。為了調(diào)查我國(guó)不同品系雞中外源性ALV的感染狀況和病毒的致病特性，本研究分別從進(jìn)口祖代白羽肉雞、海藍(lán)褐蛋雞、中國(guó)某地方品系雞采樣接種DF-1細(xì)胞，分離到3株外

2、源性ALV，依次為SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E1。另有本實(shí)驗(yàn)室從另一地方品系雞分離到的外源性ALV，SDAU09E2，對(duì)這4個(gè)分離株進(jìn)行了全基因組測(cè)序。選擇毒株SDAU09C1和SDAU09C3分別接種白羽肉雞、HN蛋雞、SPF雞的5日齡雞胚，同時(shí)以ALV-J亞群病毒NX0101作為參照，比較了三株病毒對(duì)不同品種雞的致病性。
　　 1 A亞群禽白血病病毒的分離鑒定
　　 240只直接進(jìn)口祖代白羽肉雞

3、在潔凈度105的SPF動(dòng)物房飼養(yǎng)到7日齡時(shí)，分別無(wú)菌采集抗凝血；從某海藍(lán)褐蛋雞場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)采集30份抗凝血，從中國(guó)某地方品系雞采集30枚雞蛋，無(wú)菌條件下運(yùn)送到本實(shí)驗(yàn)室。將樣品適當(dāng)處理后接種DF-1細(xì)胞，培養(yǎng)9d或14d后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清用禽白血病病毒p27抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALV p27抗原，抗原陽(yáng)性上清再次感染空白DF-1細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，再次測(cè)得p27抗原陽(yáng)性樣品即為分離到的外源性ALV。
　　 2四株A亞群禽白血病病毒的序列分析<

4、br>　　 設(shè)計(jì)7對(duì)重疊引物，以病毒感染DF-1細(xì)胞基因組DNA為模板分別從4株外源性ALV的前病毒基因組DNA中擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測(cè)序后，利用DNAStar軟件將彼此重疊的核苷酸片段拼接，獲得前病毒全基因組序列。并對(duì)各基因產(chǎn)物進(jìn)行序列分析
　　 2.1分離株gp85的序列比較
　　 4個(gè)分離株的gp85基因大小不同，編碼氨基酸序列與10株ALV-A亞群參考株的同源性均在87.7％以上，而與ALV

5、-B、C、D、E亞群參考株的同源性僅在76.9％-85.5％之間，與ALV-J亞群參考株的同源性平均僅為38％左右。進(jìn)化樹(shù)分析也顯示4個(gè)分離株與ALV-A亞群參考株的同源關(guān)系最近。這表明4個(gè)分離株均屬于ALV-A亞群病毒。
　　 2.2分離株gag和pol的序列比較
　　 4個(gè)分離株的gag pol大小與各亞群參考株一致，編碼的氨基酸序列相對(duì)保守，與各亞群參考株的同源性分別在95.4％和97.3％以上。
　　 2

6、.3分離株gp37的序列比較
　　 4個(gè)分離株的gp37基因大小不同，編碼氨基酸序列均與內(nèi)源性病毒ev-6的同源性最高，在92.1％-95.9％之間。
　　 2.4分離株LTR區(qū)的序列比較
　　 4個(gè)分離株的LTR大小不同，其中SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2三株LTR大小與外源性ALV參考株一致，序列同源性在85-90.7％之間，而與內(nèi)源性病毒參考株的序列同源性最高只有70％。但SDAU09

7、E1株LTR大小與內(nèi)源性病毒參考株一致，核苷酸序列與內(nèi)源性病毒參考株和美國(guó)報(bào)道的疫苗污染株P(guān)DRC-1039、PDRC-3246、PDRC-3249的同源性最高，在91.3-93.5％之間，而與外源性病毒參考株的同源性平均僅為66％。
　　 2.5分離株U3區(qū)的序列比較
　　 在LTR序列內(nèi)的U3區(qū)，分離株SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2與內(nèi)源性參考株和3個(gè)疫苗污染株的同源性平均僅為51％，而與外源性

8、病毒參考株的同源性在82.4-92.5％之間；分離株SDAU09E1與內(nèi)源性病毒參考株和3個(gè)疫苗污染毒株的同源性在82.7％-97.5％之間，而與外源性病毒參考株的同源性小于50％。序列分析表明，SDAU09E1的U3區(qū)主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與外源性病毒參考株一致，而其它3個(gè)分離株的U3區(qū)主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與外源性病毒參考株一致。這表明，SDAU09E1基因組中帶有內(nèi)源性病毒LTR序列，SDAU09C1、SDAU09C3、SDAU09E2的LT

9、R區(qū)屬于外源性病毒序列。
　　 3四株A亞群禽白血病病毒在細(xì)胞上的復(fù)制水平比較
　　 將4株分離毒等量接種DF-1細(xì)胞，p27抗原ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，SDAU09E2在DF-1細(xì)胞上的復(fù)制速度最快，SDAU09C1次之，SDAU09C3低于SDAU09C1，而SDAU09E1復(fù)制很慢。病毒滴度檢測(cè)結(jié)果顯示，相同條件下，SDAU09C1的TCID50最高，SDAU09E2次之，SDAU09C3低于SDAU09E2，而S

10、DAU09E1的TCID50值顯著低于其它3株病毒（最小相差100倍）。4株分離毒在DF-1細(xì)胞上復(fù)制水平的差異可能與它們U3區(qū)啟動(dòng)子活性密切相關(guān)。
　　 4不同毒株的致病性比較
　　 4.1 SDAU09E1和SDAU09C1的感染性比較
　　 用SDAU09E1和SDAU09C1等量腹腔注射1日齡SPF雞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SDAU09C1攻毒雞產(chǎn)生了免疫耐受，持續(xù)泄殖腔p27抗原陽(yáng)性，沒(méi)有產(chǎn)生抗體反應(yīng)，且橫向傳

11、播能力較強(qiáng)。SDAU09E1攻毒雞僅表現(xiàn)一過(guò)性病毒血癥，抗體反應(yīng)很慢，沒(méi)有發(fā)生橫向感染。這表明帶有內(nèi)源性LTR特別是U3序列的病毒SDAU09E1對(duì)SPF雞的感染能力顯著低于病毒SDAU09C1。
　　 4.2 SDAU09C1和SDAU09C3對(duì)白羽肉雞、蛋雞、SPF雞的不同類型致病性比較
　　 選擇分離株SDAU09C1和SDAU09C3分別接種白羽肉雞、HN蛋雞、SPF雞的5日齡雞胚，同時(shí)以本實(shí)驗(yàn)室分離的ALV-J

12、亞群毒株NX0101作為對(duì)照，比較三株病毒對(duì)不同品種雞的致病性。
　　 4.2.1三株ALV對(duì)不同品種雞的致腫瘤性
　　 對(duì)自然死亡雞的解剖發(fā)現(xiàn)，在20w-27w內(nèi)，SDAU09C1和SDAU09C感染的白羽肉雞分別出現(xiàn)1例腫瘤病例，NX0101感染的白羽肉雞分別出現(xiàn)2例腫瘤病例；SDAU09C1感染的HN蛋雞出現(xiàn)1例腫瘤病例，NX0101和SDAU09C3感染的HN蛋雞均沒(méi)有出現(xiàn)腫瘤；SDAU09C1感染的SPF雞有4

13、只表現(xiàn)為骨硬化，1只表現(xiàn)為腎臟腫大和肝萎縮，SDAU09C3感染的SPF雞有1只表現(xiàn)為骨硬化，NX0101感染的SPF雞出現(xiàn)3只腫瘤病例。而且腫瘤類型表現(xiàn)比較復(fù)雜。3株ALV感染不同品種雞腫瘤類型的多樣化及致腫瘤數(shù)的差異可能與病毒特性、宿主的遺傳背景及宿主的個(gè)體差異有關(guān)。
　　 4.2.2三株ALV對(duì)不同品種雞免疫水平的影響
　　 三株ALV感染3個(gè)品種雞在第6w時(shí)測(cè)得脾臟與體重比、胸腺與體重比、法氏囊與體重比在統(tǒng)計(jì)學(xué)水

14、平上沒(méi)有發(fā)生顯著變化（P>0.05），而三株ALV感染的不同品種雞針對(duì)NDV、AIV-H9、AIV-H5疫苗免疫產(chǎn)生了不同程度的免疫抑制。
　　 4.2.3三株ALV對(duì)不同品種雞的感染性比較
　　 病毒血癥、泄殖腔p27抗原和血清抗體的檢測(cè)結(jié)果顯示，NX0101雞胚接種在白羽肉雞產(chǎn)生的感染程度比在HN蛋雞嚴(yán)重，與SPF雞水平相當(dāng)，但在白羽肉雞中的橫向傳播水平較高，在HN蛋雞和SPF雞中的橫向傳播能力較弱。SDAU09C1

15、雞胚接種在部分SPF雞產(chǎn)生了免疫耐受，而且橫向傳播水平較高，在白羽肉雞僅誘導(dǎo)產(chǎn)生-過(guò)性病毒血癥，橫向傳播水平較低，在HN蛋雞引起的感染程度介于白羽肉雞和SPF雞之間，但可以產(chǎn)生較高水平的橫向傳播。SDAU09C3接種SPF雞胚引起耐受性病毒血癥，橫向傳播水平較高，接種HN蛋雞雞胚產(chǎn)生的感染程度和橫向傳播水平低于SPF雞，接種白羽肉雞雞胚產(chǎn)生的感染和橫向傳播能力都很低。這表明NX0101對(duì)白羽肉雞和SPF雞的感染性最高，SDAU09C1和

16、SDAU09C3對(duì)SPF雞和HN蛋雞的感染程度高于對(duì)白羽肉雞。而且在SPF雞，三株病毒產(chǎn)生的感染程度為SDAU09C3>SDAU09C1>NX0101；在HN蛋雞，為SDAU09C1>SDAU09C3>NX0101；在白羽肉雞，為NX0101>SDAU09C1>SDAU09C3。
　　 4.2.4三株ALV對(duì)不同品種雞的其它致病類型比較
　　 三株ALV感染3個(gè)品種雞在生長(zhǎng)發(fā)育上表現(xiàn)出不同程度的抑制，病毒NX0101感染

17、白羽肉雞的體重水平最低，病毒SDAU09C3感染HN蛋雞的體重水平最低，病毒SDAU09C1和NX0101感染SPF雞體重水平低于病毒SDAU09C3感染的SPF雞。血常規(guī)分析顯示，三株ALV感染不同品種雞的血液白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)在1w-15w沒(méi)有發(fā)生顯著變化（P>0.05）。但在第21w時(shí)，SDAU09C1和SDAU09C3感染白羽肉雞的白細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；SDAU09C3和NX0101感染SPF雞的