鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體的制備及快速檢測方法的建立.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是引起鴨傳染性漿膜炎的病原菌，它主要侵害以水禽為主的多種家禽而引起急性或慢性傳染病。發(fā)病病鴨常表現(xiàn)出嗜睡、歪頸、跛行、排黃綠稀糞，眼鼻有漿液性分泌物，隨后出現(xiàn)痙攣、角弓反張等神經(jīng)癥狀。以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎為其病變特征。鴨傳染性漿膜炎病死率高，又可引起鴨生產(chǎn)性能降低，且治療費(fèi)用較高，可造成較高的經(jīng)濟(jì)損失。因此如何準(zhǔn)確、快速的診斷成為

2、防治該病的關(guān)鍵。本研究利用全菌免疫法研制了針對鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體，并建立了檢測鴨疫里默氏桿菌的雙抗體夾心ELISA方法、免疫膠體金方法和PCR檢測方法，為該病的快速檢測和疾病控制提供了有力的技術(shù)支撐。
　　 1、鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體的制備
　　 本研究利用RA全菌作為免疫原，用弗氏完全佐劑乳化后皮下多點(diǎn)注射免疫BALB/c小鼠，2周、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐劑乳化的抗原再各免疫一次；6周后不加佐劑，取相

3、同劑量抗原腹腔注射小鼠，最后一次免疫3天后取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得RA單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株共四株，分別命名為2F7、3C9、5G7和2E6。單抗2F7的亞類為IgG2b，單抗2E6、5G7、3C9為IgG3。這四種單抗與鴨源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，其中單抗5G7與已知血清型1、2、3、11型RA菌株反應(yīng)，其他3株只與1、2、3型RA株反應(yīng)。Western-blot結(jié)果顯示單抗5G

4、7可結(jié)合45KD左右蛋白條帶。
　　 2、鴨疫里默氏桿菌快速檢測方法的建立
　　 用血清1型RA菌株免疫兔制備RA的多抗血清，純化單抗及多抗血清，用于建立雙夾心ELISA。其中用多抗作為捕獲抗體，單抗作為檢測抗體，用184ng/孔純化的多抗包被過夜；封閉液選擇10％小牛血清37℃封閉2h；檢測抗原、多抗、酶標(biāo)抗體37℃作用1h；顯色20min后用終止液終止，讀取OD450，讀值高于0.330且P/N>2.1，判定為陽性。

5、所建立的雙抗體ELISA方法與禽源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌無交叉反應(yīng)，模擬樣品的最低檢測劑量為104CFU。以單抗5G7研制的免疫膠體金試紙條有良好的特異性，均不與巴氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌反應(yīng)，與四個(gè)型的RA都反應(yīng)。模擬樣品的最低檢出劑量為6×103CFU。根據(jù)16srDNA序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出384 bp的目的條帶，以此建立快速PCR的檢測方法，該方法同樣具有較好的特異性，與鴨源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌都不反應(yīng)，而四種血清

6、型的RA均可擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。模擬樣品的最低檢出細(xì)菌濃度200CFU，最低檢測RADNA含量20pg。在臨床病料樣品檢測的結(jié)果顯示PCR、雙抗體夾心ELISA、免疫膠體金檢測方法與傳統(tǒng)細(xì)菌分離方法的陽性檢出率分別為40.7％(11/27)、55.6％(15/27)、51.9％(14/27)、40.7％(11/27)。與細(xì)菌分離方法相比，三種方法的符合率分別為PCR92.6％、膠體金試紙法88.9％、雙抗體夾心ELISA法為85.2％。因此