鴨疫里默氏桿菌毒力基因的鑒定及功能分析.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌可感染鴨、鵝、火雞等多種鳥(niǎo)類引起多發(fā)性滲出性炎癥和全身性敗血癥。家鴨感染后，以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等廣泛的纖維素性炎癥為臨床特征。本病在世界各地廣泛分布，具有較高的發(fā)病率和死亡率，是引起養(yǎng)鴨業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的傳染病之一。目前，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中關(guān)于鴨疫里默氏桿菌的全基因組序列信息非常有限，并且，鴨疫里默氏桿菌的致病機(jī)制仍不清楚。為了更好地研究鴨疫里默氏桿菌的遺傳規(guī)律和致病機(jī)制，本研究測(cè)定了血清2型鴨疫里默氏桿菌

2、強(qiáng)毒菌株Yb2的全基因組序列，并采用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)誘變技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)對(duì)鴨疫里默氏桿菌毒力基因進(jìn)行了鑒定和功能分析。
　　本研究運(yùn)用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)鴨疫里默氏桿菌Yb2株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，經(jīng)序列拼裝和基因缺口修補(bǔ)，最終得到一條完整的線性基因組序列，長(zhǎng)度為2，184，066 bp，GC含量為35.73％。Yb2基因組包含2，073個(gè)基因，38個(gè)tRNA，6個(gè)rRNA和1個(gè)其他非編碼RNA。經(jīng)IslandVi

3、ew軟件預(yù)測(cè)，Yb2基因組含6個(gè)基因島，編號(hào)為GI-1～GI-6。在2，021個(gè)具有明確生物學(xué)功能的蛋白中，1,214個(gè)蛋白具有COG分類，1，217個(gè)蛋白具有KEGG的ortholog。分析脂多糖合成途徑蛋白，預(yù)測(cè)獲得11個(gè)與脂多糖合成相關(guān)的基因，主要參與類脂A的合成。基因組比對(duì)分析發(fā)現(xiàn):Yb2基因組與DSM15868、RA-GD、RA-CH-1和RA-CH-2菌株基因組的共線性區(qū)塊數(shù)依次為50、29、203和42;Yb2基因組存在4

4、個(gè)倒位同源性區(qū)塊，但是并無(wú)大片段序列的重排現(xiàn)象?；?6S rDNA構(gòu)建了鴨疫里默氏桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其中Yb2與RA-GD處于同一分支，表明它們之間親緣性最高。
　　通過(guò)接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，將轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機(jī)插入到Y(jié)b2基因組，并通過(guò)紅霉素和卡那霉素雙抗篩選和PCR擴(kuò)增鑒定，構(gòu)建了共含有突變株3，175株的轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫(kù)。以野生株Yb2的100 LD50作為攻毒劑量感染櫻桃谷鴨，篩選不引起雛鴨發(fā)病死亡的突變株，共獲得100株

5、減毒突變株。Southern blot分析獲得62株單一插入位點(diǎn)的減毒突變株，通過(guò)反向PCR和染色體步移技術(shù)共鑒定到49個(gè)插入失活基因。將鑒定的基因進(jìn)行比對(duì)、COG分類和膜定位分析，結(jié)果表明:在鑒定的49個(gè)基因中，25個(gè)(51％)基因編碼胞漿蛋白，6個(gè)(12％)基因編碼胞漿膜蛋白，4個(gè)(8％)基因編碼外膜蛋白，其余14個(gè)(29％)基因的編碼產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位未知。通過(guò)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行COG功能分類，這些基因編碼的蛋白中，16個(gè)蛋白與“met

6、abolism”相關(guān)，6個(gè)蛋白與“cellular processing and signaling”相關(guān)，4個(gè)蛋白歸類于“information storage and processing”，其他23個(gè)蛋白的COG分類未知。測(cè)定了22株減毒突變株的LD50，結(jié)果表明:通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選的突變株，其毒力均有不同程度的減弱，且至少比野生株Yb2減弱100倍。
　　通過(guò)玻片凝集試驗(yàn)篩選減毒突變株，獲得1株失去血清凝集能力的突變株，命名

7、為RA2640。Southern blot表明轉(zhuǎn)座子在RA2640基因組中僅有一個(gè)插入位點(diǎn)，測(cè)序顯示插入失活的基因?yàn)锳S87_04050。qRT-PCR分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)座子的插入不影響AS8704050上、下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，表明突變株RA2640生物學(xué)特性的改變?cè)从贏S8704050基因的功能失活。RA2640能被結(jié)晶紫著染，表明其LPS表型由光滑型轉(zhuǎn)變?yōu)榇植谛?。SDS-PAGE分析純化的LPS，結(jié)果顯示RA2640的LPS在分子量為1

8、3 kDa、20 kDa處有目的條帶，而野生株Yb2的LPS在分子量為13 kDa、20 kDa和25 kDa處有目的條帶，即突變株RA2640合成不完整的LPS，表明AS8704050基因參與LPS的合成。
　　突變株RA2640對(duì)抗生素、去污劑（Triton X-100）、消毒劑(H2O2)和健康鴨血清的敏感性顯著地高于野生株，表明LPS的完整性在細(xì)菌抵抗力方面發(fā)揮著重要的作用。對(duì)突變株RA2640黏附、入侵Vero細(xì)胞的能力

9、進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明RA2640的黏附、入侵能力均顯著高于野生株，可能粗糙型細(xì)菌黏附、入侵細(xì)胞的機(jī)制不同于光滑型細(xì)菌。應(yīng)用18日齡櫻桃谷鴨對(duì)突變株的毒力進(jìn)行檢測(cè)，其LD50測(cè)定為1.91×1010 CFU，表明其毒力下降約100，000倍（野生株Yb2的LD50為1.07×105 CFU）。更重要的是，RA2640感染18日齡櫻桃谷鴨后，不能在其體內(nèi)存活，在感染后3h就能被機(jī)體清除，而相同劑量的野生株感染雛鴨，3h后血液載菌量為2.51×

10、104 CFU/mL，24h后可達(dá)6.04×106 CFU/mL?；貜?fù)株cRA2640能全部或部分回復(fù)抗生素敏感性、去污劑及消毒劑抵抗性、健康鴨血清抵抗力、黏附入侵能力、致病性等生物學(xué)特性至野生株水平，表明AS87_04050基因與鴨疫里默氏桿菌LPS的合成及致病性相關(guān)。
　　簡(jiǎn)言之，本研究完成了血清2型鴨疫里默氏桿菌強(qiáng)毒菌株Yb2的全基因組序列測(cè)定，并與Genbank公布的其他4株鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行了序列比對(duì)分析。首次采用轉(zhuǎn)座子